二代測序在膝關節置換術后遲發性感染關節液中病原菌檢測中的應用價值

趙玲 李浩然 郭巍 張韶輝 崔青

關節置換手術后人工關節發生感染是臨床常見并發癥，常見感染類型包括急性、遲發性、慢性[1]，其中遲發性感染發病緩慢，發病后病情多呈惡化趨勢。傳統微生物培養鑒定時間較長，若遇厭氧菌及難鑒定細菌，鑒定時間常延至7天甚至更久，并且可能存在假陰性結果。二代測序技術是隨著分子生物學發展、基于PCR而形成的一種病原菌診斷方法，敏感性高，檢測速度快[2]。近年來，二代測序逐漸用于感染性病原菌的識別與鑒定，在血液樣本微生物檢測中有較高應用價值[3]。本研究利用二代測序技術與傳統微生物培養共同測定膝關節置換術后遲發性感染病人關節液中的病原菌類型，探討二代測序在膝關節置換術后感染中的應用價值。

對象與方法

一、對象

選取2014年2月～2019年3月我院收治的膝關節置換術后合并感染病人41例，其中初次關節置換后感染7例，翻修術后感染34例。年齡37～71歲，平均年齡(58.47±3.51)歲，男20例，女21例。骨性關節炎26例，類風濕性關節炎15例，骨水泥假體置換22例，非骨水泥假體置換19例。納入標準：(1)符合肌肉與骨骼感染協會(muscularskeletal infection society，MSIS)的人工關節假體感染標準[4]；(2)初次膝關節置換手術后及翻修術后感染；(3)人工關節處有疼痛、紅腫、局部發熱癥狀；(4)發生感染時間均在術后5個月～2年內；(5)入院后停用抗生素2周再取樣進行微生物培養。排除標準：膝關節置換手術前合并全身性感染或為開放性骨折；關節液量不足以用于二代測序及實驗室微生物培養；合并惡性腫瘤；合并全身免疫系統疾病及長期使用免疫抑制劑類藥物。本研究獲醫學倫理委員會批準，所有病人及家屬對本研究內容充分知曉，自愿簽署知情同意。

二、方法

1.檢測方法：對所有病人取樣，收集關節液。在膝關節的髕骨上方經股四頭肌腱外側向內穿刺進關節囊，抽取3 ml關節液，分2部分注入2支無菌管中，一部分保存至-80℃冰箱中，一部分送至我院微生物實驗室。所有標本均在抽取后30分鐘內接種完成。培養基選擇血平板、巧克力平板、需氧血培養瓶、厭氧血培養瓶。血培養瓶放置美國BD公司BACTECTM FX40全自動血培養系統中。培養出的細菌均采用梅里埃VITEK 2 Compact微生物自動鑒定系統進行鑒定。

對保存于-80℃冰箱的關節液進行細菌DNA提取。方法：解凍后使用加樣槍取200 μl標本轉入新的無菌管中，采用DNeasy Blood& Tissue kit試劑盒進行DNA提取，操作步驟參考試劑盒說明書。取略大于500 ng提取完成的模板DNA，進行二代測序：首先進行細菌16S rDNA基因的PCR擴增，PCR反應條件為95℃ 2分鐘預變性，95℃ 5秒變性、60℃ 30秒退火、60℃ 30秒延伸，循環45次。再將擴增得到的DNA分析進行DNA文庫制備、emPCR平行擴增、測序。測序所得結果中去除長度<50 bp的低質量、低復雜度序列，得到高質量的序列，同時消除人源基因組干擾。結果判讀：由計算機將測序得到的序列對比數據庫中細菌序列，識別鑒定出各種細菌。采用USEARCH軟件中UPARSE算法對二代測序中每個樣本中檢出的細菌序列多樣性及豐度進行分析：(1)對有效序列進行聚類，將有97%序列相似度的序列歸為一個操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)；(2)使用USEARCH軟件及相應數據庫，將每個OUT代表序列與數據庫進行對比，計數每個樣本注釋到不同細菌分類水平上的序列數；(3)使用QIIME軟件計算樣本α多樣性，包括Chao1、ACE、Simpson、Shannon指數，Chao1與ACE指數主要體現樣本物種豐度信息，Simpson與Shannon主要體現物種多樣性信息，ACE及Chao1指數越大表示物種豐富度越高，Shannon指數越大表示物種多樣性越高，Simpson指數越趨近于0表示物種多樣性越高。

2.觀察指標：兩種方法對41例病人關節液中細菌檢出情況；41例病人由二代測序測得的樣本α多樣性。

三、統計學分析

應用SPSS 23.0軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.膝關節置換術后合并感染病人典型病例：女，63歲。雙膝關節骨關節炎，右側膝關節置換術后6個月發生感染。見圖1。

2.41例病人二代測序與細菌培養的細菌檢出率比較：在種水平上分析兩種方法最終檢出的細菌情況，細菌培養未檢出停乳鏈球菌，兩種方法均未檢出真菌。細菌培養結果中，有29例(70.73%，29/41)病人同時感染了2種細菌，1例病人檢出3種細菌(優勢菌2種，另一種推測是由于樣本污染導致)；二代測序檢出同時感染2種細菌的病人為34例(82.93%，34/41)，且其中囊括細菌培養檢出的29例病人，另有1例病人檢出6種細菌。二代測序檢出的感染金黃色葡萄球菌病人13例(70.73%，13/41)明顯多于細菌培養5例(12.20%，5/41)(P<0.05)。見表1。

A.初次全膝關節置換術前雙膝關節正位X線片示雙側膝關節間隙狹窄、骨質增生、硬化；B.全膝關節置換術后雙膝關節正位x線片示假體位置良好；C.右側膝關節置換術后6個月發生感染正位x線片，右脛骨平臺下骨質溶解，脛骨側假體松動。

表1 41例患者二代測序與細菌培養的細菌檢出情況(例，%)

3.41例病人由二代測序測得的樣本α多樣性：二代測序得到41例病人樣本中細菌ACE指數平均為(12 834.06±317.52)，Chao1指數平均為(8 025.37±351.08)，Simpson指數(0.53±0.01)(圖2)、Shannon指數(5.06±0.11)(圖3)。

圖2 Simpson指數

討論

雙脫氧法測序是利用某種DNA聚合酶延伸結合待定序列模板上的引物，一直結合到某種終止核苷酸為止[5]。21世紀分子生物學新型微生物鑒定方法已發展到第二代測序法，即高通量測序[6]。二代測序在一次測序后就能獲得所有病原菌的DNA序列，成本低，合成、延伸、測序步驟可同時進行，縮短測序時間[7]。目前，應用較廣的二代測序技術包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Single Molecule Sequencer等[8]，在癌癥分型、病毒鑒定領域逐步發揮優勢[9-10]。二代測序還可以通過與抗生素耐藥基因數據庫和毒力因子數據庫進行對比，分析細菌的耐藥基因及細菌毒力[11]。二代測序成本相對較低，但目前測序設備的費用仍較高，臨床有二代測序需求時，常委托第三方實驗室進行測序。

本研究中納入的遲發性感染病人是指在術后數月、數年后才出現感染癥狀的病人，此類病人一旦發病，病情進展迅速[12]。遲發性感染多因術中創口污染或術后創口愈合不良，淺層創口逐漸侵入深部，在關節深部定植并累及其他部位。傳統實驗室細菌培養在區分多種類型的細菌時不具有優勢，這是因為一個培養基營養有限，若一個病人的某種樣本中存在多種細菌，會發生爭奪營養情況，這不利于了解病人病原菌詳細分布類型。另外，多種細菌在同一培養基上生長時可能出現菌落混合生長的情況，此時需要進行仔細分離純化，若遇細菌污染情況，分離純化結果不良，則需進行二次取樣培養，大大延長細菌培養鑒定時間。如本院中對于血培養儀中細菌的檢測，需氧菌需3～5天才能得到結果，厭氧菌則需7天才能出結果。因此，通過二代測序方式對膝關節置換術后遲發性感染的病人進行詳細、全面的病原菌鑒定非常有必要。

本研究發現二代測序檢出的細菌種類囊括了傳統細菌培養檢出的細菌種類，表明二代測序法在關節液細菌的鑒定中有重要臨床意義。傳統細菌培養未檢出任何感染了停乳鏈球菌的病人，而二代測序檢出5例感染了停乳鏈球菌的病人。這表示二代測序可檢測并鑒定出傳統細菌培養無法鑒定出的細菌類型。同時，二代測序鑒定出感染金黃色葡萄球菌的病人占70.73%，高于傳統細菌培養的12.20%。二代測序鑒定出感染表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、無乳鏈球菌、化膿性鏈球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑氏不動桿菌的病人比例雖然與細菌培養比較差異不明顯，但仍可以看出二代測序檢出的感染以上細菌病人比例高。表明二代測序在鑒定以上細菌時較細菌培養更敏感。兩種方法鑒定出感染大腸埃希菌的病人比例相同，且經對比發現是相同6例病人。表明對于大腸埃希菌，二代測序與細菌培養鑒定結果具有一定一致性，不會產生較大偏倚。其原因可能是由于大腸埃希菌是常見的革蘭陰性致病菌，其生長環境對營養要求不苛刻、菌落易識別，常規實驗室培養基上即可直接檢出。兩種方法均未檢出真菌，表示在本研究中41例病人不存在真菌感染，也提示膝關節置換術后遲發性感染病人中真菌感染率低。本研究傳統細菌培養最多在1例病人關節液樣本中檢出3種細菌，但從該病人的微生物平板內細菌分布情況來看，其中有1種細菌可能是由于樣本污染造成的，因此檢出的致病菌仍為2種，而二代測序結果顯示最多在1例病人的關節液樣本中檢出6種細菌，其中占優勢的致病菌有3種。由此可見，傳統細菌培養的精準性確實低于二代測序，且依賴人工的經驗。從二代測序后的細菌群落豐富度及多樣性分析，本研究中Simpson指數約為0.05，Shannon指數處于中等水平。雖然Simpson指數不明顯趨近0，但ACE及Chao1指數體現出較高水平，表明在41例病人關節中，采用二代測序可檢出較高物種豐度，對微生物多樣性檢出的水平還有待研究。

總體而言，在本研究納入的膝關節置換術后感染的病人中，均可檢出致病菌，二代測序能檢出高物種豐度，在微生物多樣性方面，二代測序檢出的細菌多樣性也較多，既可囊括傳統細菌培養檢出的細菌種類，又可檢出細菌培養無法檢出的細菌種類。朱逸敏等[13]研究表明，二代測序已成為病原學診斷的有效方式，與傳統細菌培養方式比較具有快速、定量分析的優點，但二代測序發展到現階段仍缺乏明確的公認的判讀標準，后續仍需通過增大樣本量，通過與傳統細菌培養相比，進一步驗證二代測序的優勢。