TLR4在臨產前后孕婦外周血中的表達及與下游相關信號通路激活的關系

陳自喜 趙蘊芝 朱兆偉 張孟哲 李曉曉 相芬芬 吳蓉 康向東

[摘要] 目的 研究Toll樣受體4（TLR4）在臨產前后孕婦外周血中的表達及與下游相關信號通路激活的關系。方法 收集上海中醫藥大學附屬普陀醫院2018年3月—2019年8月收治住院的孕婦外周血及子宮肌組織，根據是否臨產分為足月臨產組（21例）和足月未臨產組（20例）。采用流式細胞術、酶聯免疫吸附法檢測孕婦外周血TLR4的表達，RT-PCR法檢測子宮肌組織中TLR4、收縮相關蛋白及核因子（NF）-κB、MAPK家族JNK、ERK、P38 mRNA表達并進行相關性分析。 結果 兩組孕婦的年齡、孕齡、體重指數比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。兩組孕婦的外周血中性粒細胞、單核細胞及血清TLR4表達水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組孕婦子宮肌組織中TLR4、CX43及OTR比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組孕婦NF-κB、ERK、P38、JNK mRNA水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。TLR4與收縮相關蛋白CX43、OTR和信號通路JNK、ERK、P38、NF-κB呈正相關（R2 = 0.619、0.416、0.438、0.426、0.55、0.332，均P < 0.01）。JNK、ERK、P38、NF-κB與收縮相關蛋白CX43呈正相關（R2 = 0.548、0.393、0.702、0.600，均P < 0.01）;與OTR呈正相關（R2 = 0.308、0.608、0.532、0.514，均P < 0.01）。結論 TLR4可能通過激活下游NF-κB/MAPK通路，促進收縮相關蛋白的表達，促進子宮收縮，在分娩啟動中發揮重要作用。

[關鍵詞] Toll樣受體4;分娩;收縮相關蛋白;信號通路

[中圖分類號] R714? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（a）-0010-04

Expression of TLR4 in maternal peripheral blood before and after parturition and its relationship with activation of downstream signaling pathways

CHEN Zixi1*? ?ZHAO Yunzhi2*? ?ZHU Zhaowei1? ?ZHANG Mengzhe1? ?LI Xiaoxiao1? ?XIANG Fenfen1? ?WU Rong1▲? ?KANG Xiangdong1▲

1.Department of Laboratory Medicine， Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai? ?200062， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai? ?200062， China

[Abstract] Objective To analyze the expression of Toll-like receptor 4 （TLR4） in maternal peripheral blood before and after parturition and its relationship with activation of downstream signaling pathways. Methods The peripheral blood and uterine muscle tissue of pregnant women admitted to Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine from March 2018 to August 2019 were collected and divided into term labor group （21 cases） and term non labor group （20 cases） according to whether or not labor. The expression of TLR4 was detected by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay. RT-PCR was used to detect the expression of TLR4， contraction related protein， nuclear factor （NF）-κB， JNK， ERK and P38 mRNA in uterine muscle， and their relationships were analyzed. Results There was no significant difference in age， gestational age and body mass index between two groups （P > 0.05）. There were significant differences in the expression levels of peripheral blood neutrophils， monocytes and serum TLR4 between two groups （P < 0.05）. There were significant differences in TLR4， CX43 and OTR between two groups （P < 0.05）. There were significant differences in the mRNA levels of NF-κB， ERK， P38 and JNK between two groups （P < 0.05）. TLR4 was positively correlated with CX43， OTR， JNK， ERK， P38 and NF-κB （R2 = 0.619， 0.416， 0.438， 0.426， 0.55， 0.332， all P < 0.01）. JNK， ERK， P38 and NF-κB were positively correlated with CX43 （R2 = 0.548， 0.393， 0.702， 0.600， all P < 0.01）， JNK， ERK， P38 and NF-κB were positively correlated with OTR （R2 = 0.308， 0.608， 0.532， 0.514， all P < 0.01）. Conclusion TLR4 may play an important role in labor initiation by activating downstream NF-κB/MAPK pathway， promoting the expression of contraction related proteins and promoting uterine contraction.

[Key words] Toll-like receptor 4; Parturition; Contraction-associated protein; Signaling pathw

早產是指妊娠滿28周但不足37周的分娩，全球早產的發生率為5%～18%[1]，我國發生率為8%[2-3]。早產和足月分娩有著共同的分娩機制，只是由于生殖道感染、宮內炎癥[4-5]等導致分娩時間提前。及時闡明分娩啟動的機制，有助于臨床有效防治早產的發生。Toll樣受體4（TLR4）是Toll樣受體家族中重要的模式識別受體之一，在天然免疫中發揮重要作用[6-8]。研究發現，母胎界面存在TLR4表達，且表達量隨著妊娠階段不同而改變，TLR4介導母胎間的免疫耐受，參與宮內炎癥反應過程[9]。此外，TLR4不僅與早產的發生密切相關，而且參與正常分娩過程[10-11]。本課題組前期研究發現，在早產和足月產的人絨毛膜組織中TLR4的表達明顯升高[12]。為了進一步證實TLR4與分娩啟動有關，筆者于臨床上收集足月臨產和足月未臨產孕婦的外周血及子宮肌組織，初步探討TLR4在分娩啟動中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

獲得上海中醫藥大學附屬普陀醫院（以下簡稱“我院”）醫學倫理委員會批準，在孕婦知情同意的前提下，收集2018年3月—2019年8月我院收治的孕婦外周血及子宮肌組織，根據是否臨產分為足月臨產組（21例）和足月未臨產組（20例）。實驗所需孕婦入選標準：孕婦年齡25～28歲，單胎，孕37～42周。排除標準：妊娠肥胖癥、妊娠心血管疾病、妊娠高血壓疾病、妊娠糖尿病等妊娠期合并癥者。

1.2 樣本處理

收集孕婦外周血3 mL于含EDTA試管和普通管中，在孕婦子宮下段行剖宮產術，待胎兒娩出，沿上緣切口近中線處取1.5 g子宮肌。放入-80℃冰箱，待后續實驗進行操作。

1.3 儀器與試劑

ELISA試劑盒（江蘇科特生物科技有限公司）;TLR4流式抗體（賽默飛世科技有限公司）;PCR反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒（天根生物科技有限公司）;引物由上海生工有限公司合成;熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7300）;流式細胞儀（BD FACSCanto），引物序列見表1。

1.4 檢測方法

1.4.1 流式細胞術檢測外周血單核細胞、中性粒細胞中TLR4表達? 100 μL全血中加入10 μL的TLR4流式抗體，避光20 min，加入稀釋后的溶血素混勻，避光10 min，1200 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清，加入2 mL的PBS，混勻，1200 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清，加入0.5 mL的PBS，1 h內上機檢測。

1.4.2 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清TLR4水平? 外周血3500 r/min離心15 min，離心半徑13.5 cm，吸取血清，按ELISA試劑盒說明書檢測TLR4水平。

1.4.3 實時熒光定量PCR方法檢測子宮肌組織中TLR4、CAPs及信號通路的表達? Trizol試劑抽提子宮肌組織中總RNA，測定提取的濃度和純度，本研究所提取總RNA的質量和濃度均符合PCR反應要求。以β-actin為內參，RT-PCR法檢測TLR4、CAPs及下游信號通路的表達。反應條件：95℃預變性30 s;95℃變性10 s;60℃退火20 s;70℃延伸10 s，共40個循環。利用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用Pearson進行相關性分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦一般資料比較

兩組孕婦的年齡、孕齡、體重指數比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 兩組孕婦外周血中性粒細胞、單核細胞及血清TLR4表達水平比較

兩組孕婦的外周血中性粒細胞、單核細胞及血清TLR4表達水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.3 兩組孕婦子宮肌組織中TLR4及收縮相關蛋白mRNA水平比較

兩組孕婦子宮肌組織中TLR4、CX43及OTR比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表4。

2.4 兩組孕婦子宮肌組織中NF-κB、ERK、P38、JNK mRNA水平比較

兩組孕婦NF-κB、ERK、P38 mRNA水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表5。

2.5 TLR4與收縮相關蛋白及信號通路相關性分析

TLR4與收縮相關蛋白CX43、OTR和信號通路JNK、ERK、P38、NF-κB呈正相關（R2 = 0.619、0.416、0.438、0.426、0.55、0.332，P = 0.000、0.000、0.000、0.000、 0.000、0.000）。

2.6 信號通路與收縮相關蛋白相關性分析

JNK、ERK、P38、NF-κB與收縮相關蛋白CX43呈正相關（R2 = 0.548、0.393、0.702、0.600，P = 0.000、0.000、 0.000、0.000）;與OTR呈正相關（R2? = 0.308、0.608、0.532、 0.514，P = 0.000、0.000、0.000、0.000）。

3 討論

妊娠滿28周及以上胎兒從母體娩出的過程稱為分娩。妊娠絕大數時期，在孕激素作用下子宮處于靜息狀態，到了妊娠末期，在收縮相關蛋白的作用下，子宮肌產生強烈而規律的收縮，使胎兒娩出[13]。分娩的發生與炎癥反應密切相關，Toll樣受體是天然免疫模式識別受體，可通過激活機體先天性免疫觸發獲得性免疫，在炎癥反應中發揮作用[14]。研究發現，TLR4可通過上調促炎因子和趨化因子的表達促進早產發生[10]。有報道稱，感染誘導的早產中白細胞變化與未感染足月分娩過程中白細胞變化相似，這些相似可歸因于TLR4的直接或間接作用[15]。在妊娠末期，機體釋放多種內源性因子激活TLR4，而TLR4激活是引起炎癥級聯反應驅動子宮激活的關鍵，而早產和足月產的人羊膜、絨毛膜中也檢測到TLR4的表達[12，16]。本研究發現，足月臨產孕婦的外周血及子宮肌組織中TLR4的表達明顯升高，且與收縮相關蛋白之間呈顯著正相關，結果提示，TLR4在人分娩啟動中發揮重要作用。

研究發現，TLR4可調控NF-κB的活性介導炎癥反應[17]。本研究發現，NF-κB與TLR4和收縮相關蛋白的表達呈正相關。這一發現提示，TLR4可能調控NF-κB通路介導炎癥反應促進子宮激活。MAPK家族ERK和P38可促進NF-κB的激活和收縮相關蛋白表達[18-19]。研究還表明，TLR4可以誘導MAPK信號級聯反應[20]。本研究發現，足月臨產的人子宮肌組織中ERK、P38顯著增加，且與TLR4和收縮相關蛋白的表達呈正相關。結果提示，TLR4可能通過激活NF-κB/MAPK通路調節炎癥反應促進子宮激活。

綜上，TLR4在足月分娩的人外周血及子宮平滑肌中上調，并與收縮相關蛋白及下游信號通路呈顯著正相關，而信號通路的激活與子宮激活密切相關。TLR4可能通過激活下游NF-κB/MAPK信號通路，在子宮激活和分娩啟動中起重要作用。

[參考文獻]

[1]? You S，Cui AM，Hashmi SF，et al. Dysregulation of bile acids increases the risk for preterm birth in pregnant women [J]. Nat Commun，2020，11（1）：2111.

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[3]? 洪秀，盛曉園.早產發生率及高危因素及對圍產結局的影響[J].中國醫院統計，2019，26（1）：218-220.

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[6]? 熊小菊，黃鶴.Toll樣受體4與心血管疾病研究進展[J].中國心血管病研究雜志，2016，14（12）：1061-1064.

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[9]? 尹姝珂，李衛紅.子宮內膜異位癥相關細胞因子研究進展[J].大眾科技，2017，19（5）：90-92.

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[12]? 張藝凡，李星，陳自喜，等.早產和足月產妊娠組織中Toll樣受體表達水平及其下游信號通路激活的研究[J].醫學臨床專集，2017，2017：312-313.

[13]? 李樂賽，周昌菊.子宮平滑肌收縮調控機制與分娩啟動[J].中國婦幼健康研究，2011，22（5）：695-697.

[14]? 朱學農，譚玉文，張玉梅，等.Toll樣受體在先天性免疫反應中的作用[J].免疫學雜志，2006，22（3）：1-3.

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[16]? 曹耀輝.Toll受體4的表達與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關系[J].河北醫藥，2011，33（4）：565-566.

[17]? 李愛玲，修瑞娟.Toll樣受體4與原發性高血壓的相關研究[J].醫學綜述，2014，20（11）：1937-1939.

[18]? 陳昱曉，王娜，徐李玲，等.金桔精油通過抑制p38 MAPK和NF-κB信號通路減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷[J].廣西醫科大學學報，2019，36（6）：863-868.

[19]? 陳湘玲，畢穎.產前血清微量元素含量與產后出血、MAPK信號分子和PGs表達、氧化應激的關系[J].醫學院學報，2017，23（7）：928-931.

[20]? 余鎮河，朱昭瓊.TLR4參與的炎癥通路在術后認知功能障礙中的研究進展[J].遵義醫科大學學報，2019，42（6）：722-726.

（收稿日期：2020-03-16）早產是指妊娠滿28周但不足37周的分娩，全球早產的發生率為5%～18%[1]，我國發生率為8%[2-3]。早產和足月分娩有著共同的分娩機制，只是由于生殖道感染、宮內炎癥[4-5]等導致分娩時間提前。及時闡明分娩啟動的機制，有助于臨床有效防治早產的發生。Toll樣受體4（TLR4）是Toll樣受體家族中重要的模式識別受體之一，在天然免疫中發揮重要作用[6-8]。研究發現，母胎界面存在TLR4表達，且表達量隨著妊娠階段不同而改變，TLR4介導母胎間的免疫耐受，參與宮內炎癥反應過程[9]。此外，TLR4不僅與早產的發生密切相關，而且參與正常分娩過程[10-11]。本課題組前期研究發現，在早產和足月產的人絨毛膜組織中TLR4的表達明顯升高[12]。為了進一步證實TLR4與分娩啟動有關，筆者于臨床上收集足月臨產和足月未臨產孕婦的外周血及子宮肌組織，初步探討TLR4在分娩啟動中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

獲得上海中醫藥大學附屬普陀醫院（以下簡稱“我院”）醫學倫理委員會批準，在孕婦知情同意的前提下，收集2018年3月—2019年8月我院收治的孕婦外周血及子宮肌組織，根據是否臨產分為足月臨產組（21例）和足月未臨產組（20例）。實驗所需孕婦入選標準：孕婦年齡25～28歲，單胎，孕37～42周。排除標準：妊娠肥胖癥、妊娠心血管疾病、妊娠高血壓疾病、妊娠糖尿病等妊娠期合并癥者。

1.2 樣本處理

收集孕婦外周血3 mL于含EDTA試管和普通管中，在孕婦子宮下段行剖宮產術，待胎兒娩出，沿上緣切口近中線處取1.5 g子宮肌。放入-80℃冰箱，待后續實驗進行操作。

1.3 儀器與試劑

ELISA試劑盒（江蘇科特生物科技有限公司）;TLR4流式抗體（賽默飛世科技有限公司）;PCR反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒（天根生物科技有限公司）;引物由上海生工有限公司合成;熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7300）;流式細胞儀（BD FACSCanto），引物序列見表1。

1.4 檢測方法

1.4.1 流式細胞術檢測外周血單核細胞、中性粒細胞中TLR4表達? 100 μL全血中加入10 μL的TLR4流式抗體，避光20 min，加入稀釋后的溶血素混勻，避光10 min，1200 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清，加入2 mL的PBS，混勻，1200 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清，加入0.5 mL的PBS，1 h內上機檢測。

1.4.2 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清TLR4水平? 外周血3500 r/min離心15 min，離心半徑13.5 cm，吸取血清，按ELISA試劑盒說明書檢測TLR4水平。

1.4.3 實時熒光定量PCR方法檢測子宮肌組織中TLR4、CAPs及信號通路的表達? Trizol試劑抽提子宮肌組織中總RNA，測定提取的濃度和純度，本研究所提取總RNA的質量和濃度均符合PCR反應要求。以β-actin為內參，RT-PCR法檢測TLR4、CAPs及下游信號通路的表達。反應條件：95℃預變性30 s;95℃變性10 s;60℃退火20 s;70℃延伸10 s，共40個循環。利用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用Pearson進行相關性分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦一般資料比較

兩組孕婦的年齡、孕齡、體重指數比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

表2? ?兩組孕婦一般資料比較（x±s）

2.2 兩組孕婦外周血中性粒細胞、單核細胞及血清TLR4表達水平比較

兩組孕婦的外周血中性粒細胞、單核細胞及血清TLR4表達水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

表3? ?兩組孕婦外周血中性粒細胞、單核細胞及血清TLR4

表達水平比較（x±s）

注：TLR4：Toll樣受體4

2.3 兩組孕婦子宮肌組織中TLR4及收縮相關蛋白mRNA水平比較

兩組孕婦子宮肌組織中TLR4、CX43及OTR比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表4。

表4? ?兩組孕婦子宮肌組織中TLR4及收縮相關蛋白

mRNA水平比較（x±s）

注：TLR4：Toll樣受體4

2.4 兩組孕婦子宮肌組織中NF-κB、ERK、P38、JNK mRNA水平比較

兩組孕婦NF-κB、ERK、P38 mRNA水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表5。

表5? ?兩組孕婦子宮肌組織中NF-κB、ERK、P38、

JNK mRNA水平比較（x±s）

注：NF-κB：核因子-κB

2.5 TLR4與收縮相關蛋白及信號通路相關性分析

TLR4與收縮相關蛋白CX43、OTR和信號通路JNK、ERK、P38、NF-κB呈正相關（R2 = 0.619、0.416、0.438、0.426、0.55、0.332，P = 0.000、0.000、0.000、0.000、 0.000、0.000）。

2.6 信號通路與收縮相關蛋白相關性分析

JNK、ERK、P38、NF-κB與收縮相關蛋白CX43呈正相關（R2 = 0.548、0.393、0.702、0.600，P = 0.000、0.000、 0.000、0.000）;與OTR呈正相關（R2? = 0.308、0.608、0.532、 0.514，P = 0.000、0.000、0.000、0.000）。

3 討論

妊娠滿28周及以上胎兒從母體娩出的過程稱為分娩。妊娠絕大數時期，在孕激素作用下子宮處于靜息狀態，到了妊娠末期，在收縮相關蛋白的作用下，子宮肌產生強烈而規律的收縮，使胎兒娩出[13]。分娩的發生與炎癥反應密切相關，Toll樣受體是天然免疫模式識別受體，可通過激活機體先天性免疫觸發獲得性免疫，在炎癥反應中發揮作用[14]。研究發現，TLR4可通過上調促炎因子和趨化因子的表達促進早產發生[10]。有報道稱，感染誘導的早產中白細胞變化與未感染足月分娩過程中白細胞變化相似，這些相似可歸因于TLR4的直接或間接作用[15]。在妊娠末期，機體釋放多種內源性因子激活TLR4，而TLR4激活是引起炎癥級聯反應驅動子宮激活的關鍵，而早產和足月產的人羊膜、絨毛膜中也檢測到TLR4的表達[12，16]。本研究發現，足月臨產孕婦的外周血及子宮肌組織中TLR4的表達明顯升高，且與收縮相關蛋白之間呈顯著正相關，結果提示，TLR4在人分娩啟動中發揮重要作用。

研究發現，TLR4可調控NF-κB的活性介導炎癥反應[17]。本研究發現，NF-κB與TLR4和收縮相關蛋白的表達呈正相關。這一發現提示，TLR4可能調控NF-κB通路介導炎癥反應促進子宮激活。MAPK家族ERK和P38可促進NF-κB的激活和收縮相關蛋白表達[18-19]。研究還表明，TLR4可以誘導MAPK信號級聯反應[20]。本研究發現，足月臨產的人子宮肌組織中ERK、P38顯著增加，且與TLR4和收縮相關蛋白的表達呈正相關。結果提示，TLR4可能通過激活NF-κB/MAPK通路調節炎癥反應促進子宮激活。

綜上，TLR4在足月分娩的人外周血及子宮平滑肌中上調，并與收縮相關蛋白及下游信號通路呈顯著正相關，而信號通路的激活與子宮激活密切相關。TLR4可能通過激活下游NF-κB/MAPK信號通路，在子宮激活和分娩啟動中起重要作用。

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[6]? 熊小菊，黃鶴.Toll樣受體4與心血管疾病研究進展[J].中國心血管病研究雜志，2016，14（12）：1061-1064.

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（收稿日期：2020-03-16）