TIMD4在結直腸癌患者中的表達與臨床意義

張通，楊平，魏健昌，曾山崎，陳華翠，鐘俊斌，王強，李旺林，魏芳，曹杰

(廣州市第一人民醫院/廣州消化疾病中心/華南理工大學附屬第二醫院 結直腸肛門外科，廣東 廣州 510180)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康，在世界范圍內成為第4位致死的腫瘤性疾病[1]。我國CRC發病率和死亡率均位于所有腫瘤第5位[2]。手術、化療和放療是CRC的主要治療手段，但CRC患者的總生存率卻沒有顯著提高，亟待尋找新的治療手段[3]。腫瘤和免疫反應的相互作用在腫瘤發生發展中具有重要作用[3-4]，增強和促進人體免疫反應對腫瘤患者來說是一種有效的治療手段[5]。TIM家族在腫瘤微環境中調節先天及后天免疫細胞，有助于腫瘤的免疫監視和抗腫瘤的免疫反應，從而提高腫瘤的臨床治療效果[6]。TIMD4是TIM家族成員之一[6]。研究顯示，TIMD4能夠調節免疫功能及抗腫瘤的免疫反應，通過抑制腫瘤相關抗原活性，引起腫瘤微環境免疫耐受，從而抑制免疫活性[7-9]。本研究旨在進一步探討TIMD4蛋白在CRC中的表達情況及其臨床意義，為今后患者預后的預測和臨床干預效果的評價提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料The cancer genome atlas(TCGA)數據庫。組織芯片(No. co2161)包含208例結腸癌和8例正常結腸組織，購買于中國西安艾麗娜生物科技有限公司，附有所有患者的相關臨床資料。PV-6000通用型免疫組化試劑盒購自北京欣興唐生物科技有限公司，DAB顯色液購自福州邁新試劑。兔抗人多克隆TIMD4抗體(HPA015625)購買于美國Sigma公司。光學顯微鏡購買于日本Olypmus公司。PBS緩沖液、蘇木精、酒精，二甲苯、封片用樹膠由廣州市第一人民醫院病理科提供。

1.2 免疫組化采用免疫組化PV兩部法：組織芯片常規脫蠟至水，蒸餾水洗，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)浸泡5 min，微波微火抗原修復3 min，共2次，自然冷卻至室溫，體積分數為3%的過氧化氫封閉內源性過氧化物酶活性，10 min，PBS沖洗，以1∶100比例滴加TIMD抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗滴加通用型二抗(PV-6000)，37 ℃溫箱孵育40 min，PBS沖洗，二氨甲聯苯胺顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.3 表達評分組織芯片掃描后使用ImageScope 11軟件分析，2名病理醫生分別以半定量方式對TIMD4表達進行評分。染色強度評定：無為0分，弱為1分，中為2分，強為3分。染色百分比：0～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分。總分由染色強度和百分比得分相加確定。總分>4分為高表達，總分≤4分為低表達[7]。

1.4 統計學分析采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。TIMD4表達水平和臨床病理特征的關系采用Mann-WhitneyU檢驗和χ2檢驗。總生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗。單因素和多因素分析采用Cox回歸。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TIMD4mRNA表達與CRC侵犯層次的關系TIMD4mRNA高表達與較深CRC侵犯層次相關(P=0.020)。TIMD4蛋白高表達與低病理分級(P=0.046)、高臨床分期(P<0.001)、深侵犯層次(P<0.001)、有淋巴結轉移(P<0.001)、有遠處轉移(P=0.001)相關。見表1。

2.2 CRC中TIMD4蛋白表達的情況采用免疫組化檢測CRC組織芯片(208例癌組織、8例正常組織)TIMD4蛋白表達，進一步探討TIMD4蛋白表達及其與患者臨床病理特征之間的關系。圖1A示組織芯片中各樣本TIMD4蛋白表達情況。組織芯片原有208例CRC組織，免疫組化染色過程中部分CRC脫蠟，最終實驗獲得197例CRC染色。TIMD4蛋白在CRC中表達高于正常組織(P<0.01)(圖1B)。圖1C～1E顯示TIMD4蛋白主要表達于CRC和正常組織腸上皮細胞的細胞質。

2.3 TIMD4高表達是CRC患者預后不良的獨立風險因素采用Kaplan-Meier方法比較TCGA數據庫192例CRC患者中TIMD4高表達和低表達患者的總體生存時間。根據TIMD4mRNA表達量平均值將樣本分為TIMD4高表達組和低表達組[10]。TIMD4高表達組和低表達組患者術后的總生存時間分別為(40.10±6.75)和(48.54±2.95)個月。TIMD4高表達CRC患者術后總生存時間較TIMD4低表達者短(Log-rank=4.549，P=0.033)。見圖2。單因素分析顯示，TIMD4高表達是CRC患者預后不良的風險因素(HR：2.272，95% CI：1.041～7.116，P=0.041)。多因素分析進一步表明，TIMD4高表達是CRC患者預后不良的獨立風險因素(HR：2.813，95% CI：1.013～7.811，P=0.047)。見表2。

表1 TIMD4表達與CRC患者臨床病理特征關系

A為組織芯片染色圖像；B為CRC中TIMD4蛋白表達高于正常組織(P<0.01)；C為TIMD4在CRC中高表達(免疫組化染色，×100，×400)；D為TIMD4在CRC中低表達(免疫組化染色，×100，×400)；E為TIMD4在正常組織中低表達(免疫組化染色，×100，×400)。

圖2 TIMD4高低表達對結直腸癌患者生存的影響

表2 Cox比例風險回歸模型分析TIMD4在CRC中的預后價值

3 討論

目前，結直腸癌發病率及死亡率較高，嚴重威脅人類健康，雖然對其治療方法及策略已有極大改善，但預后不良仍然成為亟待解決的臨床問題[11]。機體細胞免疫系統主要通過識別腫瘤細胞，將腫瘤抗原呈遞給T細胞，激活T細胞以及對腫瘤細胞特異性殺傷[12-13]。在此過程中，激活T細胞需要協同刺激信號的協助，這些刺激信號需要“免疫檢查點”進行調控。目前關于免疫檢查點關注較多的有TIM家族和PD-1等，此類分子在腫瘤微環境免疫調節中起到至關重要的作用[14]。

TIM-4是TIM家族的一員，主要作為磷脂酰絲氨酸受體，促進凋亡細胞的吞噬[15-16]。研究表明，TIM-4能抑制TIM-4缺陷小鼠的炎癥反應并維持免疫耐受，這意味著TIM-4可能在腫瘤微環境中的免疫反應調節中發揮潛在作用[17]。在B16黑色素瘤小鼠模型的實驗中，TIMD4單克隆抗體能夠增強其抗癌反應，且TIMD4和TIM3單克隆抗體聯合使用可以進一步提高疫苗誘導的抗腫瘤活性[18]。在胃癌的體內外實驗中，阻斷TIMD4和TIM1的相互作用能夠增強免疫應答反應[19]。但TIMD4在CRC中的表達和作用尚缺乏深入研究。因此，本研究首先通過分析TCGA數據庫，發現TIMD4mRNA高表達與較深CRC侵犯層次相關。有研究報道，非小細胞肺癌患者中TIMD4的高表達與臨床預后不良顯著相關[20]。Yano等[21]發現腎細胞惡性腫瘤中高表達TIMD4提示臨床預后不良。本研究進一步分析TIMD4與結直腸癌患者臨床病理資料之間的關系，證明CRC中TIMD4蛋白表達高于正常組織，TIMD4蛋白高表達與低病理分級、高臨床分期、深侵犯層次、有淋巴結轉移、有遠處轉移相關，此結果與Tan等[22]相關研究結果相似。基于上述研究結果，推測TIMD4在腫瘤組織中高表達對患者預后具有一定預測價值，采用Kaplan-Meier生存分析法比較腫瘤組織中TIMD4表達與患者生存情況，研究結果顯示，TIMD4高表達的CRC患者術后總生存時間較TIMD4低表達者短，兩者生存情況差異有統計學意義。TIMD4在腫瘤的發生、發展過程中可能發揮負調節作用，可能由于TIMD4高表達引起機體T細胞功能障礙，從而導致腫瘤免疫逃逸作用。本研究結果顯示，結直腸癌中TIMD4高表達可作為CRC患者預后不良的獨立風險因素。

綜上所述，TIMD4在CRC組織中表達增加，且與患者組織學分型、腫瘤分期、淋巴結轉移、遠處轉移密切相關，且CRC中TIMD4高表達患者提示臨床預后不良。因此，TIMD4有望成為結直腸癌免疫治療靶向調控的一個重要靶點，也有望成為結直腸癌早期分子診斷與預后評估的重要分子。