我國25-羥基維生素D檢測方法及其研究進展

潘曉芳 吳靜標 黃燕虹 朱秀霞 黃鴻新

維生素D 是人體必需的一類脂溶性類固醇衍生物，經兩次羥基化后與細胞內維生素D 受體（Vitamin D receptor，VDR）特異性結合后，發揮其生理作用。維生素D 缺乏會引起骨骼系統、肌肉系統、心血管系統、免疫系統、神經系統、糖代謝、細胞增殖分化、內分泌系統、腫瘤等相關疾病。血清25-羥基維生素D（25-hydroxyvitamin D，25-OH VD）濃度被認為是測定全面維生素D 狀態的最可靠指標［1-3］，因而可用于測定患者是否出現維生素D 缺乏。《維生素D 及其類似物臨床應用共識》指出：血清25-OH VD 水平檢測已被公認為反映維生素D 狀態的最合理指標［2］。全球范圍內有很多人25-OH VD 缺乏，因此定期檢測25-OH VD 水平確保其充足對疾病預防意義重大［4-6］。本文綜述了液相色譜-串聯質譜法、化學發光分析法、酶聯免疫法、克隆酶供體免疫測定法、免疫層析法、膠乳免疫比濁法共6 種檢測25-OH VD 的方法，并對各個方法的優點和不足進行分析，以期為臨床選擇25-OH VD 的檢驗方法提供指導。

1 我國25-OH VD 檢測試劑盒注冊情況

《體外診斷試劑注冊管理辦法》將25-OH VD檢測試劑盒分為第二類［7］。截止2020年11月30日，檢索國家藥品監督管理局（以下簡稱國家局）國產醫療器械數據庫發現，目前國內25-OH VD 檢測試劑盒涉及的方法學主要包括液相色譜-串聯質譜法、化學發光分析法、酶聯免疫法、克隆酶供體免疫測定法、免疫層析法、膠乳免疫比濁法。

2 25-OH VD 檢測試劑盒檢測方法及其原理

2.1 液相色譜-串聯質譜法（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）

LC-MS/MS 的原理是利用被檢測物質25-OH VD2/D3 與背景干擾物如基質中的其他內源性物質在流動相和固定相中分配系數的不同進行分離。待測樣本經過色譜柱分離后流出，進入質譜離子源離子化，形成不同質荷比的氣相帶電離子。在電場的作用下，帶電離子進入Q1 四極桿質量分析器，目標母離子被特定電場選擇出來，通過Q1 四極桿，進入Q2 碰撞池，在碰撞氣體（氬氣）和一定碰撞電壓的作用下，目標母離子被打碎成若干子離子。這些子離子進入Q3 四極桿質量分析器后，在特定電場作用下，只有目標子離子被選擇出來，能通過Q3 四極桿，進入檢測器中進行檢測。整個掃描過程中目標分析物離子經過兩次選擇后，特異性和靈敏度可大大提高，最后得到對稱性良好的色譜峰。通過色譜峰的時間和峰面積等信息可以對物質進行定性或定量處理。采用內標法定量時，由于樣品中摻入了同位素標記的25-OH VD2/D3，能夠很好地消除基質效應，其分析準確度優于外標法。另外，LC-MS/MS 法能夠有效區分25-OH VD2/D3，比免疫法靈敏度更高，是臨床檢測維生素D 的金標準［2，8-10］。

研究表明，LC-MS/MS 法測定干血點、血漿、血清樣本中的25-OH VD2/D3，具有靈敏度高、分析快速、準確性好、儀器穩定等特點［11-12］。鄭仁錦等［13］利用乙腈提取、飽和硫酸鋅沉淀蛋白、然后用正己烷萃取的方法建立了超高效液相色譜-串聯質譜法-同位素標記快速測定血清25-OH VD3 的方法，該方法用于美國國家標準與技術研究院NIST972a 質控樣品及實際樣品中25-OH VD的測定，獲得了滿意的結果。廣州金域醫學檢驗中心有限公司聯合廣州醫科大學金域檢驗學院通過引入自動化取樣平臺、前處理平臺、更換色譜柱、將單通道液相改為多通道液相系統等措施將LC-MS/MS 法檢測25-OH VD 過程中樣本取樣環節檢測效率提升了21%，樣本前處理環節檢測效率提升了74%，以及液相分離環節檢測效率提升了63%［14］。

為了促進維生素D 標準化工作，2010年維生素D 標準化計劃（The Vitamin D Standardization Program，VDSP）啟動，VDSP 通過建立參考測量體系給美國國家標準和技術研究院（The National Institute of Standards and Technology，NIST）提供標準參考物質（Standard Reference Materials，SRM），從而促進全球包括商業化和自建方法在內的實驗室25-OH VD 檢測方法的標準化［15-16］。NIST 和比利時根特大學建立了同位素LC-MS/MS 法定量測定血清中25-OH VD2、25-OH VD3 的參考方法，得到了檢驗醫學溯源性聯合委員會（The Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）的認可［17-19］。但是LC-MS/MS 法儀器昂貴，安裝條件嚴格，需要較大場地方可滿足要求；樣本前處理復雜，檢測通量比較低，比較難適應臨床大批量樣本的需求；手工操作比較復雜，操作人員需要經過比較專業的培訓，難以推廣；盡管被公認為檢測25-OH VD 的金標準，LC-MS/MS 法仍然易受3-epi-25OH-D3 和3-epi-25OH-D2 等異構體的交叉影響，尤其對嬰幼兒的檢測易出現假陽性［20-23］。另外，由于色譜和質譜條件等未標準化，不同實驗室之間的處理方法和色譜條件等不同，對同一個體也會產生不同的臨床評價。

截至2020年11月30日，國內已經取得注冊證的LC-MS/MS 法測定25-OH VD2/D3 的試劑盒廠家有廣州可力質譜醫療器械有限公司、廣州豐華生物工程有限公司、上海復星長征醫學科學有限公司等10 家公司。根據查詢數據可知，以上廠家都是2019 和2020年獲得的注冊證，各家在色譜和質譜條件上也各有差異，因此要將LC-MS/MS法標準化，國內亟需解決25-OH VD 國家標準品的制備工作。

2.2 免疫法

已注冊的產品設計原理主要為競爭法。

2.2.1 化學發光分析法（Chemiluminescence Immunoassay，ECLIA）

涉及的檢測試劑盒按其發光機理具體可分為直接化學發光法、酶促化學發光法、電化學發光法［24］。

張旋等［25］對雅培全自動化學發光免疫分析儀測定25-OH VD 的檢測性能進行驗證和評估，與LC-MS/MS 法的檢測結果比較表明，雅培全自動化學發光免疫分析儀可以滿足臨床檢測的要求。邢晏等［26］利用電化學發光技術驗證血清25-OH VD試劑盒的性能指標，結果表明ECLIA 檢測25-OH VD 具有檢測周期短、靈敏度和自動化程度高、成本低等優點。卜玲等［27］建立了一種25-OH VD 磁微?；瘜W發光免疫分析法，通過檢測抗體-抗原衍生物-磁珠的復合物的光信號來測定樣本中25-OH VD 的濃度，實驗結果表明此方法具有省時、快速、穩定性和重復性好等優點，能夠克服ELISA 法結果受反應時間、溫度、加樣等因素的影響。目前，化學發光分析法雖然靈敏度高，但是其檢測成本較高，且需要特定的化學發光儀，導致其在25-OH VD 的臨床檢測中應用范圍較小。

2.2.2 酶聯免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

ELISA 一般采用競爭法原理對樣本中的25-OH VD 進行定量檢測。該法在臨床上雖然還保有一定的使用量，但因操作繁瑣，已很少有公司再繼續開發。

ELISA 和化學發光法檢測結果間的相對標準偏差隨著25-OH VD 濃度的升高而減?。?8］。武姍姍［29］應用SPSS 軟件比較LC-MS/MS、ECLIA 以及ELISA 兩兩方法測定血清25-OH VD 結果的相關性和一致性，結果顯示25-OH VD2 含量極低時，三種方法測定血清25-OH VD 呈高度正相關，LC-MS/MS 和ELISA 之間的結果一致性良好。

截至2020年11月30日，目前國內已經拿到注冊證的酶聯免疫法檢測25-OH VD 或25-OH VD3 的試劑盒有廣州菲康生物技術有限公司、北京正旦國際科技有限責任公司等6 家公司。

2.2.3 克隆酶供體免疫測定法（Cloned Enzyme Donor Immunoassay，CDEIA）

CDEIA 又叫酶供體競爭法，基于β-半乳糖苷酶α-互補性原理，利用DNA 重組技術制備酶受體（Enzyme Accept，EA）和酶供體（Enzyme Donor，ED）兩個片段的β-半乳糖苷酶。EA 和ED 只有在合適條件下結合在才具有酶活性，利用EA 和ED特性建立的均相酶免測定稱為CDEIA。CDEIA 同樣采用競爭法原理進行檢測，ED 標記的25-OH VD 抗原與其特異性抗體結合后由于空間位阻不能再與EA 結合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。反應平衡后，剩余的ED 標記25-OH VD 抗原與EA 結合形成具有活性的酶，加入底物測定酶活力，酶活力的大小與樣本總25-OH VD 抗原標本含量成正比，通過特定波長的吸光度變化值，可以得出25-OH VD 的濃度。

上海復星長征醫學科學有限公司的“25-羥基維生素D 測定試劑盒（克隆酶供體免疫測定法）”是國內首個在全自動生化儀上用于檢測血清樣本中25-OH VD 的試劑盒，比市場同類產品有一定優勢，操作簡便，其檢測結果與英國Immunodiagnostic Systems Limited 公司生產的試劑檢測結果的相關性良好，各項分析性能完全能夠達到指標要求，可為臨床診斷提供科學依據［30］。

2.2.4 熒光免疫層析法（Fluorescence Immunochromatography Asaay，FICA）

熒光免疫層析技術多采用競爭法原理設計，將預處理后含有待測組分的樣本與熒光物標記的25-OH VD 單克隆抗體結合，形成熒光物-抗體-抗原的復合物。在層析作用下，該復合物沿著硝酸纖維膜向前層析至檢測區（T 區），與T 區包被的25-OH VD-BSA 修飾抗原競爭結合。游離的熒光標記抗體層析至質控區（C 區），與C 區包被的二抗結合結合，形成質控區的熒光條帶。在激發光源的作用下，熒光物質發射特定波長的熒光信號，熒光免疫分析儀俘獲熒光信號。由于樣本中的25-OH VD 與T 區的修飾抗原呈競爭關系呈競爭關系，因而T 區熒光強度與樣本中的25-OH VD 濃度成反比，熒光免疫分析儀通過信號轉化及設定的定標曲線自動轉化為定量數值，計算出樣本中25-OH VD 的濃度。

沈駿［31］利用量子點具有激發光譜寬，發射峰窄而對稱，抗光漂白能力強等特點，建立了量子點熒光微球免疫層析法檢測25-OH VD 的方法，結果表明方法精密度高、準確性良好。

普通熒光免疫層析法反應時間短，檢測成本較低，對檢測人員的要求不高，方便其在基層醫院廣泛推廣，但是存在靈敏度低、重復性差等問題?；诖似辗铺匾嫠股锟萍迹ū本┯邢薰狙邪l了一種高靈敏檢測25-OH VD 的時間分辨熒光免疫層析檢測試劑，該方法試劑盒既有普通熒光免疫層析法的優點，又可以解決靈敏度低等問題。但缺點依然是只能檢測總25-OH VD［32］。

2.2.5 膠乳免疫比濁法（Latex Immunoturbidimetry）

膠乳免疫比濁法主要利用抗體標記的膠乳微球與抗原反應形成交聯網結構，它會引起特定波長的吸光度發生改變，吸光度的變化與血清樣本中的25-OH VD 的含量成正比。

深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司的“25-羥基維生素D（25-OH VD）測定試劑盒（膠乳免疫比濁法）”利用膠乳免疫比濁法測定人血清中25-OH VD 的含量。該方法與普通臨床生化檢測的使用方法相似，但由于反應成分較多，目前市面上多使用三試劑的形式，如邁瑞、美康等。該方法可適用于全自動生化分析儀，實現自動化操作，血清樣本無需進一步前處理步驟即可檢測，出結果時間短，一般在10 分鐘內可測出濃度。該方法參與反應的成分較多，且是生物活性物質，如底物、酶、抗體等，由于涉及抗體和酶的相互作用，抗體和酶等關鍵原材料篩選對于方法的建立至關重要，另一方面，各成分之間的比例協調對方法的線性、靈敏度有很大影響。因此該方法的原材料篩選及配方開發都有較大的難度。同時，由于相關的酶、抗體要求較高，原料本身的獲取不易，而進入生產端的檢驗難度也相應提高，因此也加大了該方法的研發及制造成本。目前膠乳免疫比濁法相關的檢測試劑盒廠家比較少，查詢數據顯示目前有13 家企業獲得注冊證。

3 結論

綜上所述，相比于LC-MS/MS 法，免疫法檢測樣本用量少、檢測設備相對便宜、儀器操作簡單，適用于在中層和基層醫院開展。但是與LC-MS/MS 法相比，免疫法易存在以下問題：①基質效應和交叉反應，容易使檢測結果偏高；②檢測結果為總25-OH VD，易低估25-OH VD2 的水平，導致總25-OH VD 檢測結果偏低；③無法區分25-OH VD2 和25-OH VD3，導致免疫法特異性差。即便是LC-MS/MS 也面臨5-OH VD 與結合蛋白徹底分離，的問題。眾方法中特別是ELISA 檢測時間較長，人工操作繁瑣，因此不適合單樣本檢測?？傊?，目前無論哪種免疫法的試劑盒在檢測精確性上都無法與LC-MS/MS 25-OH VD 檢測試劑盒媲美。

盡管25-OH VD2 和25-OH VD3 的結構差異小，但是由于二者的活性和治療效果有一定的差異，因此分別檢測25-OH VD2 和25-OH VD3 并對二者活性和功能單獨進行評價，是正確評估維生素D 水平和維生素D 補充療法療效的必然選擇。所以LC-MS/MS 的普及和方法標準化將是未來發展趨勢之一。

實際中開展檢驗項目時，應綜合考慮費用、空間、耗時等問題，每個單位都可以根據自身需求選擇不同的檢測方法，然而實現所有方法一致性和可比性的最佳途徑仍然是制定標準化和規范性的參考測量程序與國家標準品。