耳聾基因突變檢測試劑盒行業標準的建立

張娟麗 曲守方 孫楠 張文新 孫晶 于婷★ 黃杰★

耳聾是一種普遍高發的聽力障礙性疾病，病因復雜。環境因素、遺傳因素均可導致耳聾的發生，其中至少有50%的學語前耳聾是由遺傳因素導致的。大多數遺傳性耳聾是由幾個較為常見的熱點突變引起的［1-2］，其中中國人群常見耳聾突變主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4以及線粒體的12S rRNA基因突變［3-5］。目前有多種耳聾基因突變檢測試劑盒，方法包括芯片法、熒光PCR 法、飛行時間質譜法、測序法等。由于各試劑盒的檢測原理、檢測的突變位點及數量存在一定差異，需要對這類試劑盒的性能指標進行統一尺度的評價，來保障臨床樣本檢測結果的準確性。建立耳聾基因突變檢測試劑盒的行業標準就勢在必行。中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱本院）已完成熒光PCR 法、微陣列芯片法、測序法等多個耳聾基因檢測試劑盒的注冊檢驗，具有豐富的檢驗經驗，并且在2017年研制完成耳聾基因突變檢測國家參考品［6］，為該類試劑盒的注冊檢驗提供了可靠的參考品，該參考品已經在全國范圍內使用了近2年。本院聯合1 家省級醫療器械檢測機構及7 家企業開展了建立耳聾基因突變檢測試劑盒行業標準的工作，現將該行業標準的驗證情況作一簡要匯報。

1 材料與方法

1.1 試劑盒

十五項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒（微陣列芯片法），北京博奧生物有限公司生產；九項耳聾基因檢測試劑盒（生物芯片法），北京博暉創新生物技術股份有限公司生產；耳聾易感基因檢測試劑盒（PCR+導流雜交法），潮州凱普生物化學有限公司生產；先天性耳聾基因檢測試劑盒（熒光PCR 法）、藥物性耳聾基因檢測試劑盒（熒光PCR法）和PDS 基因檢測試劑盒（熒光PCR 法），濟南英盛生物技術有限公司生產；四項耳聾基因檢測試劑盒（ARMS-PCR 法），中生北控生物科技股份有限公司生產；二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒（飛行時間質譜法），廣州市達瑞生物技術股份有限公司生產；耳聾基因突變檢測試劑盒（聯合探針錨定聚合測序法），華大生物科技（武漢）有限公司；遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（測序法），廣州市金圻睿生物科技有限責任公司。

1.2 參考品

耳聾基因突變檢測國家參考品：批號：360013-201701，包含20 個陽性參考品（P1-P20）和3 個陰性參考品（N01～N03）。除P19 和P20 為DNA 樣本外，其余參考品均為干血片。重復性參考品由各試劑廠家自行提供。

1.3 主要檢測儀器

10K-B 微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物有限公司）、核酸芯片檢測儀（北京博暉創新生物技術股份有限公司）、HB 2012A 導流雜交儀（潮州凱普生物化學有限公司）、ABI 7300 熒光PCR 儀（美國ABI 公司）、Bio-Rad S1000PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）、DR MassARRAY 飛行時間質譜檢測系統（廣州市達瑞生物技術股份有限公司）、BGISEQ-500基因測序儀（華大生物科技（武漢）有限公司）、BioelectronSeq 4000 基因測序儀（東莞博奧木華基因科技有限公司）。

1.4 行業標準中各技術指標及驗證方法

在充分調研并分析各試劑質量標準的前提下，結合臨床應用情況，按照GB/T1.1 2009 的要求，制定了耳聾基因突變檢測試劑盒行業標準，內容包括前言、范圍、規范性引用文件、要求、試驗方法、標簽和使用說明書以及包裝、運輸、貯存7 個條款。其中“要求”和“試驗方法”是核心內容，要求中包含外觀、檢測限、準確性、特異性和重復性。

1.4.1 外觀

在自然光下目視檢查。制造商應根據自己產品的包裝特點規定適當的外觀要求。一般應有試劑盒各組分組成、性狀；內外包裝、標簽清晰等的要求。

1.4.2 檢測限

應包括試劑盒檢測范圍內的全部基因型別。按照說明書中的操作方法，取國家陽性參考品中未包含的試劑盒檢測范圍內突變位點的企業檢測限參考品，以及取試劑盒檢測范圍內的國家陽性參考品稀釋至試劑盒聲稱濃度后，各檢測1 次；或取企業檢測限參考品，各檢測1 次，均要求檢出相應的基因型別。

1.4.3 準確性

應包括試劑盒檢測范圍內的全部基因型別。按照說明書中的操作方法，取國家陽性參考品中未包含的試劑盒檢測范圍內突變位點的企業陽性參考品，以及取試劑盒檢測范圍內的國家陽性參考品，各檢測1 次；或取企業陽性參考品，各檢測1次，均要求檢出相應的基因型別。

1.4.4 特異性

按照說明書中的操作方法，取國家陰性參考品和試劑盒檢測范圍外的國家陽性參考品，各檢測1 次；或取企業陰性參考品，各檢測1 次，結果均應為陰性或野生型。

1.4.5 重復性

根據試劑盒檢測范圍內的基因種類及突變類型來確定重復性參考品，每種基因至少選擇1 個突變位點/類型。按照說明書中的操作方法，取企業重復性參考品，重復檢測10 次，結果應一致且應檢出相應的基因型別。

2 結果

2.1 外觀

全部試劑盒外觀均滿足要求。

2.2 檢測限

將試劑盒檢測范圍內國家陽性參考品稀釋至1 ng/μL，大部分廠家的試劑均可檢出，僅廠家E 在檢測1 ng/μL 濃度的國家參考品時，在1494 反應體系檢出P4、P6、P16、P19、N03 異常，P12 突變，而未能檢出P20 突變；在SLC 反應體系檢出P4、P15、N01 異常，P12 突變，而未能檢出P11 的IVS7-2 突變；在GJB 反應體系檢出P4、P15、N01 異常，多個國家參考品檢出235delC 突變；以上考慮為樣本濃度低于試劑盒聲稱檢測限所導致的結果異常，后按照試劑盒的檢出限稀釋樣本至5 ng/μL 時，均可檢出。

根據以上檢測結果以及網上征求意見和多次會議討論，最終確定檢測限指標如下：對于芯片法，檢測限應不高于20 ng/反應或2 ng/μL；對于質譜法，檢測限應不高于5 ng/反應或1 ng/μL；對于熒光PCR 法，檢測限應不高于10 ng/反應或2 ng/μL，若PCR 擴增后采用化學顯色或者電泳-凝膠成像等方法對結果進行判讀的試劑盒，檢測限應不高于15 ng/反應或1 ng/μL；本行標中未涉及到其他原理試劑盒的檢測限可參考以上進行設定；并且檢測結果可僅滿足總反應量或者濃度兩個指標之一；對于mtDNA12S rRNA突變百分比的檢測限暫不做要求，企業可根據臨床樣本實際突變百分比，進行系列稀釋，自行確認試劑盒的突變百分比檢測限。

2.3 準確性

大部分廠家結果滿足要求。除已知突變外，廠家C 還檢出國家參考品P19 的299M 雜合突變，國家參考品P9、P16 的1555 突變，不滿足要求。

2.4 特異性

大部分廠家結果滿足要求。廠家C 檢出國家陽性參考品P14（突變位點為試劑盒檢測范圍外，作為陰性參考品使用）存在1555 突變，不滿足要求。

2.5 重復性

檢測企業重復性參考品，結果均滿足要求。由于存在多種檢測方法的試劑盒，雖均為定性產品，但是部分試劑盒可以產出用于計算變異系數的數據，因此，最終確定的要求也有所不同，要求：①對于質譜法、芯片法等檢測原理的試劑盒，以及PCR 擴增后采用化學顯色或者電泳-凝膠成像等方法對結果進行判讀的試劑盒，重復性參考品的檢測結果應一致且型別準確；②對于熒光PCR 法檢測試劑盒，重復性參考品的檢測結果應型別準確，且相應檢測通道Ct 值（或Tm 值或關鍵性判讀指標）的變異系數（CV%）應不大于5.0%。

3 討論

運用分子診斷技術檢測耳聾基因突變位點的檢測方法較多，除傳統的限制性片段長度多態性法以外，還有：①一代測序技術，Sanger 測序目前仍為基因檢測的金標準，但成本高、耗時長、對操作人員要求高；②基因芯片技術，具有自動化、高通量、微型化，結果判讀方便，但對樣本DNA 質量要求高，且可檢測的突變位點有限；③基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術，具有準確高效、檢測位點多等特點，但該技術對樣品純度要求更高、儀器昂貴、對人員技術要求高；④下一代測序（NGS）技術，通過大量數據和生物信息學分析手段來判定，具有通量更高、速度更快等優點。此外，還有高分辨率熔解曲線技術、侵染檢測技術、多色探針熔解曲線分析技術等，上述方法各有優劣［7-11］。目前已有多家企業根據自己的技術優勢及實際情況，研發了多種耳聾基因突變檢測試劑，主要為測序法、芯片法、質譜法、PCR 法。國內已上市銷售的耳聾基因突變檢測試劑盒有9 個，尚有多家企業正在進行相關工作。這些試劑在臨床上已得到了廣泛的應用，超過60 萬新生兒受益。然而各類試劑盒因檢測原理、檢測位點和檢測能力范圍不同，存在一定技術水平差異，2019年之前并無這類試劑盒的行業標準或國家標準，客觀上無法進行統一尺度的評價，所以本院開展了耳聾基因突變檢測試劑盒行業標準的申報。

本次行標起草單位及驗證單位覆蓋了國內耳聾基因突變檢測試劑盒的主流廠家，方法也全面覆蓋，其優勢在于意見來源廣泛且驗證數據充分，使確定的各指標更加嚴謹、更具可操作性。在檢測限項目中，由于各方法原理本身的限制，個別試劑在樣本濃度為1 ng/μL 的條件下，難以正確檢出突變位點，此時可考慮適當提高檢測限濃度，但并不直接提高至該檢測試劑盒聲稱的檢測限。這樣做的目的是，既不違背現有試劑盒的客觀檢測水平，同時可促進企業改進方法，提高檢出率。在準確度和特異性項目中，個別試劑出現了假陰性和假陽性的結果。出現以上情況，企業應積極查找原因，解決問題。這也是建立行業標準的意義所在。要指出來的是，在制定過程中，有以下幾個討論熱點問題：①適用范圍：由于測序法與PCR 或者芯片法等方法的檢測原理存在一定差異，有其特征性的性能指標，如建庫失敗率，測序深度、測序質量評價等，不完全適用本行業標準的應用范圍，故經討論，去掉適用范圍中的基于測序原理的耳聾基因突變檢測試劑盒；②檢測限項目中：a.對于線粒體異質性的確認受限于目前的檢測技術，以及臨床陽性樣本的難以獲得性，不列為評價指標。b.對于其他位點的突變，因各檢測方法原理不同，分別確定檢測限指標，并通過實驗來確認；c.干血片提取后的DNA 含量一般較低，質量較差，各試劑檢測原理及上樣量不同，如果按提取總量制定檢測限指標，并不能客觀地評估試劑盒的檢測能力，最終選擇總反應量或濃度來評價試劑盒的檢測限；不再對重復性參考品的性質描述為強/中陽性和弱陽性，改為根據突變基因種類設置重復性參考品。

綜上所述，該行業標準正式發布以后，與耳聾基因突變檢測國家參考品配合使用，將有助于促進各廠家改進檢測能力，提高試劑質量，有效提高耳聾患兒的檢出率，實現優生優育。同時，將為該類產品的研制、檢測檢驗及上市后的監管工作提供必要的技術指導和依據。