抗腫瘤血管生成治療聯(lián)合免疫治療的理論基礎與前景

施成煒 徐志遠 魏申譽 莫少偉 呂航 程向東

作者單位： 310053 浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（施成煒 魏申譽 莫少偉）

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院（徐志遠 程向東）

310006 浙江省消化系統(tǒng)腫瘤中西醫(yī)結合診治重點實驗室（呂航）

近年來，腫瘤免疫治療的出現給人類“攻克”腫瘤帶來了新的希望。免疫治療能夠通過抗腫瘤的免疫反應提高患者對化療的敏感性，而化療更能通過增強腫瘤細胞的免疫原性及對免疫殺傷的敏感性，促進抗原交叉提呈和抗腫瘤效應。然而，目前大多數癌癥患者并未從免疫治療中受益。免疫治療依賴于免疫支持性腫瘤微環(huán)境（TME）內免疫效應細胞的積聚和活性。有研究表明，大多數實體腫瘤產生免疫逃逸與血管異常有關，而腫瘤血管的異常是血管生成因子（VEGF）和促血管生成素2（ANG 2）水平升高所致?？寡苌梢蜃影邢蛩幬锏氖褂每梢允菇Y構異常的腫瘤血管正?；瑢仍诘拿庖咭种菩訲ME轉化為免疫支持性TME，從而促進免疫效應細胞對腫瘤的殺傷作用。因此，聯(lián)合應用抗血管生成治療和免疫治療可以提高免疫治療的有效性，降低免疫相關不良反應的風險。本文就腫瘤血管生成與免疫細胞的相互作用進行分析，以期為抗腫瘤血管生成聯(lián)合免疫治療在抗腫瘤治療中提供借鑒。

1 異常的血管生成促進腫瘤進展

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展得益于血管的招募。腫瘤血管不僅運輸氧氣和營養(yǎng)物質，而且為腫瘤細胞轉移擴散和免疫細胞浸潤提供通道［1］。相對于良性組織，腫瘤的血管在結構和功能上均是異常的。血管異?；ㄟ^灌注損傷導致腫瘤環(huán)境的低氧和低pH值，從而促進腫瘤的進展，因為腫瘤細胞可以適應這些環(huán)境條件，并且比正常細胞具有更好的生存優(yōu)勢。血管異常和灌注受損也會限制細胞毒性藥物和免疫細胞從體循環(huán)進入腫瘤，從而使腫瘤逃避免疫。異常的TME可以降低藥物和免疫細胞在腫瘤中的活性。腫瘤血管異常化和TME的形成所帶來的不良后果還包括炎癥、纖維化、基因組不穩(wěn)定、DNA甲基化、向無氧代謝的轉變、對自噬和凋亡的抵抗、誘導腫瘤干細胞程序、上皮-間質轉化以及腫瘤細胞的侵襲和轉移［2］。在下面的章節(jié)中，作者詳細闡述了血管生成因子在介導免疫抑制和腫瘤轉移中的作用。

1.1 VEGF在免疫抑制中的作用 在各種血管生成因子中，VEGF在TME中具有不同的活性，在腫瘤模型中，VEGF在局部和全身免疫抑制中的作用得到了廣泛的研究［3-4］。TME中水平過高的VEGF至少通過四種不同的機制誘導腫瘤相關免疫抑制。首先，VEGF的增加直接抑制細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的增殖、轉運和免疫應答功能。Voron T等［5］研究證明腫瘤微環(huán)境中產生的VEGF可以增加CD8+T細胞上PD-1以及其他抑制性檢查點的表達，從而抑制T細胞的免疫功能；第二，VEGF抑制樹突狀細胞（DC）成熟和抗原提呈，從而阻礙T細胞活化，進而抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫應答。Gabrilovich等［6］研究表明在機體內，VEGF達到病理濃度后會對多能干細胞產生影響，進一步抑制DC的分化，同時影響造血干細胞其他種系的分化；第三，高水平的VEGF促進免疫抑制細胞的募集和增殖，包括Treg細胞、MDSCs和M2型TAMs；第四，VEGF能促進血管生成，導致腫瘤血管畸形，造成TME中缺氧和低pH，從而促進局部和系統(tǒng)性免疫抑制。

1.2 Ang 2在免疫抑制中的作用 與VEGF比較，ANG 2作為血管生成的另一個關鍵調節(jié)因子，其免疫調節(jié)作用尚不清楚。然而有研究表明激活的ANG 2信號可通過多種機制促進腫瘤的免疫抑制。首先，ANG 2通過上調粘附分子來增加白細胞-內皮細胞的相互作用，從而促進MDSC、Treg細胞和表達TIE2的單核細胞（TEMs）的聚集，誘導免疫抑制。Scholz等［7］研究發(fā)現ANG2可以通過旁分泌的方式調節(jié)β2-整合素，進而調節(jié)髓系細胞的浸潤。Coffelt等［8］研究表明ANG2可以刺激TEMs分泌IL-10，而IL-10可以抑制T細胞的增值，增加CD4+/CD8+T細胞的比例，擴大Treg細胞的數量。其次，ANG 2可以干擾內皮細胞-周細胞的相互連接，從而促進免疫細胞從血管內向TME 遷移。Holopainen T等［9］研究發(fā)現阻斷ANG2信號通路后，可以保持內皮細胞之間的完整性并促進細胞之間的連接，從而抑制腫瘤的轉移與擴散。最后，ANG 2還通過抑制腫瘤壞死因子（TNF）的分泌來調節(jié)單核細胞的功能，從而限制單核細胞的抗癌活性。此外，單核細胞溢出血管后通常分化為巨噬細胞聚集在炎癥性和惡性組織中，而組織低氧狀態(tài)會促進ANG2的表達，進一步增加ANG2對單核-巨噬細胞的抑制狀態(tài)。

2 免疫細胞促進血管生成

腫瘤相關的巨噬細胞（TAM）和中性粒細胞（TAN）通?？梢员憩F為兩類特征，一類表現為抑制血管增生以及免疫支持，另一類則表現為促血管生成和免疫抑制，但是在腫瘤中這些細胞通常被分化成免疫抑制和血管生成表型。有研究表明腫瘤微環(huán)境中的TGF-β可以誘導促腫瘤生長表型的TAN生成，抑制TGF-β后可以使促腫瘤生長表型的TAN轉化為抗腫瘤表型的TAN。此外，還有研究發(fā)現具有單核或顆粒形態(tài)的未成熟GR1細胞在腫瘤中具有促進免疫抑制的功能，因此也被稱為髓系抑制性細胞（M-MDSC和G-MDSC）［10］。在血管形成過程中，參與了多種髓樣細胞分泌的血管生成介質，包括生長因子和細胞因子。在多種動物腫瘤模型中，已有大量證據證明了髓系細胞在腫瘤血管生成及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中起著重要的作用［11］。

2.1 TAM在血管生成中的作用 TAM占腫瘤微環(huán)境中細胞的30%，常與腫瘤血管密度增加有關［12］。Lin EY等［11］在小鼠內源性乳腺病毒瘤腫瘤模型中，首次發(fā)現TAMs及其VEGF在腫瘤血管生成中具有重要作用。通過阻斷巨噬細胞上的csf 1-csf1r信號通路，或者使巨噬細胞特異性缺失VEGF，甚至通過羅膦酸脂質體廣泛消耗TAMs，結果都可以延緩血管的生成。Stockmann等［13］在多個皮下同種異體移植模型和PyMT腫瘤模型中，觀察到髓系來源的VEGF足以增加這些腫瘤對細胞毒性化療藥物的敏感性，而且敲除腫瘤內TAMs中的VEGF后能增強腫瘤對機體的適應性，促進腫瘤細胞的生長。因此，只要將血管生成減至一定水平，即可產生更多功能正常的血管，并增加周細胞覆蓋率，從而減少瘤內缺氧，促進腫瘤細胞凋亡。

表達血管生成素受體Ti2（TEK）的單核細胞（TEMs）是巨噬細胞的子集，這些單核細胞通常通過內皮細胞分泌的Tie 2配體Ang-2與血管生成密切相關。在乳腺、胰腺神經內分泌和腦腫瘤模型系統(tǒng)中，通過選擇性去除TEM上Tie 2啟動子驅動的胸苷激酶表達，或用Ang2抑制劑證明了它們與腫瘤血管生成相關性［14-15］。TEMs不僅在腫瘤進展過程中刺激了新生血管，而且對化療和放療也有反應，Russell 等研究發(fā)現經過化療后，一種M2亞型的巨噬細胞會聚集在腫瘤血管周圍，其會促進腫瘤的復發(fā)［16］。值得注意的是，這些單核細胞中Tie 2的基因缺失可以破壞其特異的血管旁定位和促血管生成的能力［15］。通過巨噬細胞中Tie 2基因的缺失來模擬腫瘤內皮細胞中Ang2缺失的作用，進一步證明了Ang2-Tie2軸是TAMs與內皮細胞之間促進新生血管的關鍵信號節(jié)點［15］。TAMs還可以表達神經和血管引導分子，用來調節(jié)細胞的生長與轉移。其中Semghin3A（Sema3A）正如腫瘤缺氧誘導的Ang2一樣，通過介導PlexinA 1/PlexinA 4/VEGFR 1復合物的NRP-1依賴性信號，促進巨噬細胞的募集和誘導血管生成。被這些分子激活后，TAMs遷移至低氧區(qū)，分泌各種免疫抑制因子和促血管生成因子。然而，一旦TAMs處于低氧環(huán)境中，Nrp-1的表達就被HIF2α介導的NFkB激活通路所抑制，TAMs對Sema3A的遷移反應終止，使這些巨噬細胞滯留在缺氧區(qū)。同樣地，Andrea 通過實驗也證明了TAMs中NRP-1的丟失可以阻止其向低氧區(qū)的浸潤，進一步轉變缺氧誘導的免疫抑制狀態(tài)、破壞了新生血管生成，從而延緩胰腺、肺癌、乳腺癌模型的腫瘤生長和轉移。Miyauchi在一種實驗性膠質瘤模型中也有類似的發(fā)現，浸潤的巨噬細胞和小膠質細胞中Nrp-1基因的缺失后，通過將細胞重新分化成免疫支持表型來發(fā)揮作用而表現出抗腫瘤效應［17］。

2.2 TAN和MDSC在血管生成中的作用 與血管生成有關的其他主要髓樣細胞類型是中性粒細胞、顆粒細胞，它們是白細胞中最豐富也是最先被招募至損傷處的細胞。中性粒細胞在防御病原體入侵中發(fā)揮著關鍵作用，它們具有吞噬微生物、從顆粒中釋放可溶性抗微生物分子、生成中性粒細胞胞外殺菌網絡（NETs）等功能。在腫瘤和轉移瘤中，中性粒細胞分泌與巨噬細胞中相似的促血管生成因子和蛋白酶，主要為VEGF、FGF和MMPs。其中Gaudry M等［18］發(fā)現中性粒細胞可以攜帶增強VEGF的顆粒，這些顆粒在接受TNF刺激后釋放因子，并能快速激活VEGF信號通路以促進血管生長。

腫瘤也會招募骨髓來源的免疫抑制細胞（MDSC），未成熟的髓系細胞可分為粒細胞（G-MDSC）和單核細胞（M-MDSC），不僅具有免疫抑制作用，而且還具有血管生成特性。Movahedi K等［19］首次研究發(fā)現MDSC能抑制人CD3和小鼠CD4或CD8 T細胞的能力，并認為MDSC的分化程序在不同的腫瘤中是有差異的。Ae Dirkx等［20］發(fā)現MDSC產生的VEGF足以抑制腫瘤相關內皮細胞粘附分子ICAM-1和VCAM 1的表達，從而限制T細胞的粘附和外滲。同時腫瘤中也有G-CSF、IL-1β和IL-6等多種因子通過STAT 3途徑激活和擴增MDSCs，促進腫瘤血管的生成，同時阻斷其向中性粒細胞或巨噬細胞的分化。

2.3 淋巴細胞調節(jié)血管生成 淋巴細胞在腫瘤血管生成中的作用尚未見報道，但最近的研究表明淋巴細胞具有直接或間接調節(jié)血管生長的能力［21-22］。此外，不同的T細胞類型對腫瘤血管生成有負性或正調節(jié)作用。CD8+T細胞和CD4+Th1細胞產生IFNγ，抑制內皮細胞增殖，并誘導TAMs中血管抑制因子CXCL 9、CXCL 10和CXCL 11的產生［23］。然而，Treg細胞在缺氧條件下產生的CCL 28促進自身分泌VEGF和抑制CD4 Th1細胞分泌INFγ，這兩者均參與了腫瘤環(huán)境中的血管生成。Tian L等［24］研究證明了腫瘤內CD4和CD8 T細胞耗竭后會加速腫瘤血管功能失調以及導致缺氧增加，而CD8+T細胞內流和通過檢查點免疫治療（抗PD1和/或抗CTLA 4）或過繼TH1的治療可使腫瘤血管正?；?，減少缺氧和腫瘤轉移。

3 抗血管生成治療促進免疫治療

免疫治療的成功取決于免疫細胞（尤其是CTL）在TME中的募集、擴增，從而產生免疫應答。T細胞的聚集是一個多步驟的過程。首先，T細胞必須與血管內皮細胞表面的粘附分子（如E-選擇素、ICAM-1和VCAM 1）相互作用，然后穿過內皮屏障進入腫瘤發(fā)揮免疫作用。Schmittnaegel M等［25］在實驗中發(fā)現雙重抗VEGF-ANG2治療可上調血管內皮細胞中粘附分子的表達，從而促進多種類型腫瘤模型中CTL的外滲和血管周圍聚集，由此可見雙抗VEGF-ANG2治療是部分呈CTL依賴性的，而血管周圍T細胞的增多又同時上調了腫瘤內皮細胞中的PD-L1表達，這也是抗血管生成治療聯(lián)合免疫治療的理論基礎。此外，免疫檢查點抑制劑（ICBS）有時會引起嚴重的免疫相關的不良事件，這些毒性反應通常可以通過停止ICB治療或減少免疫檢查抑制劑的劑量來得到緩解。而腫瘤血管正?；梢愿纳浦委熕幬飳δ[瘤的傳遞［2］。因此，聯(lián)合治療后可降低免疫檢查點抑制劑的使用劑量，從而降低免疫治療的毒性風險，提高患者生活質量及預后。

4 免疫治療促進抗血管生成治療

抗血管生成治療目前在臨床上應用較多，但是目前只有部分患者可以獲益，并且治療效果與腫瘤類型密切相關，還受到了多種腫瘤復發(fā)機制的限制。Allen E等［26］在胰腺癌，乳腺癌及腦腫瘤的模型中觀察到，在應用抗血管生成治療后，腫瘤內PD-L1的表達會上升，誘導了免疫抑制途徑，從而使PD-L 1與活化T細胞表面的PD-1結合誘發(fā)免疫抑制，導致T細胞失能或衰竭。在聯(lián)合應用抗VEGFR2和抗PD-L1治療后，成功誘導了乳腺癌和胰腺神經內分泌腫瘤中腫瘤高內皮微靜脈（HEVs）的產生，但是對膠質母細胞瘤無任何影響。這些HEVs可以激活淋巴細胞毒素β受體（LTβR）信號，提高淋巴細胞在腫瘤內的浸潤和活性，通過臨床前研究證明了抗Pd-L1治療可以使腫瘤對抗血管生成治療敏感，并延長其療效，同樣地，當抗PD-L1治療后產生了有助于增強CTL浸潤、活性和破壞腫瘤細胞的HEVs時，抗血管生成療法可以改善抗PD-L1治療。但是聯(lián)合抗血管生成治療和抗PD-L1抗體并不能改善膠質母細胞瘤模型的存活率，這種缺乏療效的原因是膠質母細胞瘤內HEVs的發(fā)生率較低［26］，這也給我們在解決聯(lián)合治療的療效問題時提供了新的入手點。由此可見，應用可誘導HEVs形成和/或增加抗原負荷的治療，包括放射、化療和癌癥疫苗，可能會提高ICB聯(lián)合抗血管生成治療的療效。

Tian L等［27］發(fā)現，在乳腺癌模型中應用CTLA-4和PD-1抑制劑可以使腫瘤血管正?；?，這一過程包括增加血管周細胞覆蓋，改善腫瘤血管灌注，降低血管通透性，減輕缺氧，從而抑制腫瘤的進展。研究中觀察到的血管正常化效應是由于CD4+Th1細胞聚集增加和抗癌活性增加所致。該實驗研究僅限于乳腺癌模型，ICB介導的血管正?；欠裨诙喾N腫瘤類型中被誘導還有待確定，但是揭示了Th1細胞可能是免疫檢查點阻斷和抗血管生成效應的標志和決定因素，也為兩種治療方法的聯(lián)合應用提供了新的理論基礎。

5 結語與展望

目前，各種血管生成抑制劑的聯(lián)合治療方式，尤其是針對VEGF-R和Ang2-TIE軸的聯(lián)合治療方法，以及免疫檢查點抑制劑和其他免疫治療方法，在臨床上得到了評價。免疫檢查點抑制劑已經成為癌癥治療的一個里程碑。然而，ICB雖然可以顯著延長部分患者的存活時間，但通常無法改善其余大多數患者的預后，并且存在較大的副作用。抗血管生成藥物只能提高幾個星期至幾個月的少量生存獲益，并且容易產生耐藥。因此，將這兩種治療方法聯(lián)合起來可能具有改善患者預后，降低副反應的潛力。

目前，靶向VEGF途徑的藥物的劑量是一個關鍵的考慮因素。高劑量和/或長時間的抗VEGF治療與腫瘤灌注水平降低和缺氧加重有關［12］。靶向抑制ANG2-TIE2藥物對VEGF通路的阻斷雖然延長了血管正?；拇翱?，并將免疫抑制的微環(huán)境轉化為免疫刺激分子，但是隨著時間的推移，腫瘤微環(huán)境再次缺氧，并通過在TME的腫瘤細胞和基質細胞（包括ECs和免疫細胞）上調PD-L1來避免這一聯(lián)合治療途徑。因此，迫切需要優(yōu)化與icb聯(lián)合使用的抗血管生成藥物的劑量、持續(xù)時間和給藥順序，來為臨床應用做出更好的指導。此外，也有研究證明了ARBs類藥物可以減少腫瘤的基質膠原和透明質酸的產生，從而減少血管壓力，改善血流灌注，達到加強化療療效的目的［28］。因此，將ARBs與抗血管生成藥物和免疫檢查點抑制劑進行聯(lián)合試驗也具有廣闊的治療潛力。

針對抗血管生成治療聯(lián)合免疫治療的許多臨床試驗也正在進行中，第一項隨機研究試驗（NCT 01984242）也已發(fā)表，并評價了在腎細胞癌（MRCC）患者中，抗PD-L1（Atezolizumab）聯(lián)合貝伐單抗與標準治療方案蘇尼替尼比較效果更好［29］。這些臨床試驗結果符合臨床前研究，也進一步證實了抗血管生成治療聯(lián)合腫瘤免疫治療的科學性和有效性，更期待之后陸續(xù)的臨床試驗結果。