幽門螺桿菌生物膜的形成 致病性及其耐藥性

周杰挺 谷海瀛

作者單位：315211 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種革蘭氏陰性，微需氧的人類病原體，目前已證實Hp感染與多種胃十二指腸慢性疾病密切相關(guān)，包括慢性活動性胃炎，消化性潰瘍，萎縮性胃炎，黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤和胃癌。據(jù)報道，世界上超過一半的人口受Hp感染，在發(fā)展中國家年齡＞50歲的人群中Hp感染率高達(dá)80%［1］，這給公眾健康帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)Hp以來，對于Hp的研究主要集中在浮游態(tài)和非附著的生長方式上；然而，越來越多的證據(jù)表明Hp可以以一種被稱為生物膜的表面附著方式呈群落生長，這種生長模式有助于病原微生物在惡劣環(huán)境中的存活及抵抗抗生素的干預(yù)治療和宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，從而延長感染時間，導(dǎo)致慢性感染［2］。目前，關(guān)于Hp生物膜的研究仍處于早期階段，其形成及其在致病中發(fā)揮的作用尚不明確，因此，本篇綜述將介紹近年來關(guān)于Hp生物膜形成相關(guān)分子機(jī)制及其生物膜致病作用的最新研究進(jìn)展。

1 胃部幽門螺桿菌生物膜的形成

2006年，Carron等［3］使用掃描電子顯微鏡（SEM）首次觀察到致密成熟的Hp生物膜存在并附著于人胃黏膜活檢標(biāo)本的上皮細(xì)胞上。近年來，Attaran B等［4］在小鼠模型中也證實了Hp生物膜的形成。他們使用SEM和多克隆抗Hp特異性免疫熒光抗體觀察到Hp在小鼠胃黏膜上形成了生物膜，表現(xiàn)出與在人類胃黏膜上一樣的潛力，由無定型細(xì)胞外基質(zhì)包裹的球形細(xì)菌牢固地附著在上皮細(xì)胞上。而且Cammarota等［5］報道，對于有≥4次Hp根除失敗病史的患者中，胃活檢標(biāo)本的SEM分析顯示Hp在所有患者的胃黏膜上形成生物膜，并且當(dāng)Hp被根除時，所有患者的生物膜都消失了。目前，尚不清楚體內(nèi)生物膜基質(zhì)是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的，還是宿主衍生的基質(zhì)（例如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白）抑或兩者兼而有之。需要進(jìn)一步的研究來確定宿主細(xì)胞對生物膜細(xì)胞外基質(zhì)的作用。Hp除了可在胃黏膜上皮細(xì)胞表面定植，還可以在胃腸道的腺體中定植［6］。這些腺體為Hp提供了一個良好的生長保護(hù)性環(huán)境。在Hp感染2～4周后，約有50%的腺體受到侵犯，達(dá)到平均25～40個細(xì)菌/腺體的腺體密度，在慢性感染中也有約10%的腺體受到侵犯。然而，在胃腺體中發(fā)現(xiàn)的Hp聚集體與生物膜中的生長方式相似，這可能是導(dǎo)致慢性感染的一個原因。因此，深入研究Hp生物膜生長方式在定植和持久性感染中的潛在作用是有必要的。

2 幽門螺桿菌生物膜形成相關(guān)的分子機(jī)制

觀察到Hp具有形成生物膜的能力至今已有20年了，近年來越來越多的研究開始聚焦于其生物膜形成的分子機(jī)制，多種方法學(xué)如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)被應(yīng)用于探索這種分子機(jī)制。

Shao C等［7］通過模擬營養(yǎng)缺乏的生存壓力環(huán)境，誘導(dǎo)Hp生物膜的產(chǎn)生，通過高分辨率二維凝膠電泳獲得浮游態(tài)Hp和早期生物膜中Hp的蛋白質(zhì)組譜，隨后應(yīng)用串聯(lián)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionzation time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-TOF MS）鑒定兩者的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，最終鑒定出了35種與Hp早期生物膜形成關(guān)系密切的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)與多種生物學(xué)功能相關(guān)，包括鞭毛運(yùn)動、細(xì)菌毒力、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)。Feng-Ling Yang等［8］比較了第4天和第7天Hp生物膜的蛋白質(zhì)譜與第4天和第7天的浮游態(tài)培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞活化蛋白A（NapA）與其他9種壓力誘導(dǎo)的蛋白（包括60-kDa伴侶蛋白、過氧化氫酶、檸檬酸合成酶等）在生物膜中表達(dá)顯著增加，同時他們構(gòu)建了NapA缺失突變的菌株，觀察發(fā)現(xiàn)相比于同基因的野生型菌株，突變株的生物膜產(chǎn)生量減少且細(xì)菌聚集也明顯減少。

在基因?qū)用妫壳把芯堪l(fā)現(xiàn)與Hp生物膜形成可能相關(guān)的基因較多且復(fù)雜，Wong EH等［9］使用結(jié)晶紫法測定了32株（1株標(biāo)準(zhǔn)菌株和31株臨床菌株）Hp的生物膜產(chǎn)量，按照生物膜的量分為少量、中等和大量三個組，之后通過對32株菌株進(jìn)行全基因組測序并將基因序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)三種假設(shè)基因K74_10375、K747_09130、K747_06625以及fucT、jhp_1117、homD 和cagA基因與生物膜形成的相關(guān)性最大。前三種基因的產(chǎn)物尚不明確，后四種基因編碼的產(chǎn)物分別為α-（1，3）-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、鞭毛蛋白、外膜蛋白和細(xì)胞毒素相關(guān)基因致病島（cagPAI）蛋白。從功能上來看，這些基因所編碼的產(chǎn)物在功能上與Shao C等研究發(fā)現(xiàn)的與Hp生物膜形成相關(guān)蛋白的功能類似。CagA基因的高表達(dá)似乎不難理解，因為普遍認(rèn)為CagA 陽性的菌株致病力較強(qiáng)，這種較強(qiáng)的毒力可能與生物膜的形成存在聯(lián)系。而鞭毛在生物膜形成中的作用同樣值得重視，Wong等［9］在對Hp體外生物膜的研究中發(fā)現(xiàn)生物膜的形成依賴于鞭毛的作用，這與鞭毛能夠促進(jìn)細(xì)菌聚集及參與外膜囊泡形成相關(guān)。另一項研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)序列分析發(fā)現(xiàn)，在Hp生物膜上調(diào)基因中包含了與鞭毛裝置形成有關(guān)的基因，進(jìn)一步證實了鞭毛結(jié)構(gòu)在Hp生物膜形成中的關(guān)鍵作用。此外，這項研究還發(fā)現(xiàn)生物膜下調(diào)的基因主要是參與代謝和翻譯的基因，而與生物膜產(chǎn)量上調(diào)相關(guān)基因的產(chǎn)物主要在細(xì)胞膜上，主要是一些參與應(yīng)激反應(yīng)的基因。表明生物膜中細(xì)菌的代謝活性較低，且生物膜的形成是一種應(yīng)激反應(yīng)［11］。

3 幽門螺桿菌生物膜與抗生素耐藥的相關(guān)性

目前，對于Hp感染的一線治療，克拉霉素（clarithromycin，CAM）耐藥性是一個日益嚴(yán)重的問題，CAM抗性臨床菌株的分離率約為10%～30%。據(jù)報道，Hp 23S rRNA基因結(jié)構(gòu)域V環(huán)中的點(diǎn)突變是產(chǎn)生克拉霉素耐藥性的基礎(chǔ)［12］。然而近年來，研究發(fā)現(xiàn)Hp生物膜與抗生素耐藥性可能也存在相關(guān)性，相比于浮游態(tài)的細(xì)胞，生物膜細(xì)胞對抗生素的抵抗力可增加100～1000倍［13］。目前，已經(jīng)提出了多種生物膜增加抗生素耐藥性的可能機(jī)制：（1）由于細(xì)胞外基質(zhì)的物理屏障作用抗生素未能滲透生物膜；（2）由于生物膜內(nèi)營養(yǎng)限制而導(dǎo)致生物膜細(xì)胞生長緩慢；（3）生物膜內(nèi)細(xì)菌在多種壓力條件下增加了突變的頻率以及抗生素耐藥菌株的產(chǎn)生；（4）生物膜內(nèi)細(xì)菌通過基因水平轉(zhuǎn)移，整合接合元件和自然轉(zhuǎn)化增加了抗生素抗性的傳播［14］。盡管Hp生物膜形成對抗生素耐藥性的影響尚未得到充分證實，已有研究發(fā)現(xiàn)Hp生物膜的形成與克拉霉素耐藥存在相關(guān)性。Yonezawa H等［15］在研究中發(fā)現(xiàn)，在CAM的最小抑菌濃度（MIC）水平上，Hp成熟（3d）生物膜相比于中間體（2d）生物膜明顯增加（由0.03增加至0.5μg/ml）；在最小殺菌濃度水平上，生物膜細(xì)菌（1.0μg/ml）比浮游態(tài)細(xì)菌（0.25μg/ml）明顯增加。而且其發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過最低抑菌濃度的CAM處理后，Hp培養(yǎng)物生物膜的產(chǎn)量相比于非處理組增加了4倍（2d生物膜）和16倍（3d生物膜）。另一項研究發(fā)現(xiàn)，Hp1174（葡萄糖/半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），這種主要促進(jìn)子超家族（major facilitator superfamily，MFS）的外排泵在生物膜形成和多重耐藥Hp菌株中高度表達(dá)，提示外排泵在Hp生物膜抗生素耐藥性增加中起到一定的作用［16］。

4 幽門螺桿菌生物膜與免疫逃逸的相關(guān)性

Hp在感染時可引起宿主上皮細(xì)胞的促炎反應(yīng)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的募集，表現(xiàn)為胃炎，盡管有強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但其仍可在體內(nèi)持續(xù)存在并最終導(dǎo)致慢性胃炎。然而目前關(guān)于Hp如何在免疫系統(tǒng)的攻擊下存活依然了解較少，生物膜的形成被認(rèn)為可能是一種躲避宿主免疫攻擊的有效機(jī)制。生物膜保護(hù)細(xì)菌免受宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)以及吞噬細(xì)胞的吞噬。生物膜還可以為細(xì)菌的水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）提供一個理想的環(huán)境，這有助于產(chǎn)生一系列具有不同抗原與毒力特征的相關(guān)細(xì)菌，最終將為細(xì)菌提供混淆和壓倒宿主免疫系統(tǒng)的手段［17］。有研究發(fā)現(xiàn)感染者對Hp的記憶性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答受損，這與Hp特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞并主動抑制其應(yīng)答相關(guān)［18］，而這種抑制可能與Hp生物膜細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。另外，有研究表明應(yīng)用鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin，CP）處理Hp培養(yǎng)物可改變細(xì)菌外膜脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低細(xì)菌表面的疏水性并增加生物膜的形成。CP是一種重要的抗菌因子，是營養(yǎng)免疫營養(yǎng)扣留過程的關(guān)鍵組分［19］。為了防止病原微生物感染，人類和其他哺乳動物通過營養(yǎng)免疫限制其獲取必需金屬［20］。很明顯，宿主的營養(yǎng)限制和細(xì)菌的營養(yǎng)獲取是傳染病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵過程。CP以高親和力結(jié)合Mn和Zn，限制這些必需金屬的傳遞，從而形成Mn和Zn限制的隔離環(huán)境。而Hp擁有通過改變外膜結(jié)構(gòu)促進(jìn)生物膜形成來規(guī)避CP抗菌活性的能力［21］。

5 總結(jié)

綜上所述，Hp生物膜的形成在感染過程中具有不可忽視的作用。相比于浮游態(tài)的細(xì)菌，對Hp生物膜的研究似乎更貼近于其對人體致病過程的真實情況。在今后的研究中，應(yīng)鼓勵研究者創(chuàng)建接近體內(nèi)環(huán)境的生物膜體外模型。事實上，生物膜不僅可以存在于胃部，還可以存在于環(huán)境中，已有研究證實水源是Hp感染的一個重要來源，研究者通過多種分子學(xué)手段在河水中檢測到了Hp的DNA，盡管目前并無證據(jù)表明Hp可以在水源中形成生物膜，但其可能嵌入其他細(xì)菌形成的生物膜中，并在其中存活［22］。另有研究表明Hp可通過在蔬菜上形成生物膜來延長其存活期［23］。因此，生物膜的形成可能是Hp在胃外環(huán)境中重要的傳播方式。另一方面，隨著CAM耐藥率的提高，根除失敗率也日益增高，然而，目前，普遍依然使用浮游細(xì)胞評估Hp菌株對體外抗生素的敏感性，但體外MIC并非人胃中抗生素效應(yīng)的可靠預(yù)測因子，所以，作者認(rèn)為對Hp生物膜形成能力的評估可以在預(yù)防和控制抗生素耐藥上發(fā)揮重要作用。此外，需要更多的研究進(jìn)一步探索Hp生物膜的致病機(jī)制，針對其形成和在致病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)開發(fā)新的預(yù)防治療策略，為提高根除效率提供新的方案。