我國土壤微生物菌群構建防控香蕉枯萎病研究進展①

杜 浩 只佳增 李宗鍇 周勁松 楊紹瓊 陳偉強

(云南省紅河熱帶農業科學研究所 云南河口661300)

香蕉枯萎病又稱巴拿馬病、黃葉病，屬國際植物檢疫對象，是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporumf.sp.cubense，Foc）［1］侵染引起的一種毀滅性的真菌土傳病害。該病我國自1960 年在廣西發現，20 年間迅速傳播至我國所有的香蕉主產區。2007 年香蕉枯萎病被我國列入進境植物檢疫性有害生物名錄［2］。目前，香蕉枯萎病的防治主要通過抗性品種選育、生物有機肥、化學防治、輪作種植等方法和措施進行。但還沒有一種理想的防治藥劑和防治方法來控制香蕉枯萎病，而生物防治方法雖起步較晚，但因其具有省工環保、生態高效等優點，逐漸發展成為公認比較安全和有效的防控香蕉枯萎病的措施之一［3］。而植物土傳病害的生物防治在一定程度上依賴于調控土壤微生物群落及其功能多樣性，土壤微生物群落結構越豐富，物種越均勻，多樣性越高，對病原菌的綜合抗性能力就越強［4］。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分［5］，它參與土壤中物質轉換和能量流動，土壤中微生物的種類、數量和分布影響著土壤肥力、有機質分解、營養循環、植物生長及土壤中有毒物質降解等方面，其多樣性也在一定程度上反映了土壤環境的質量。植物土傳病害與土壤微生物群落之間有著密切的關系［6］。

目前研究土壤微生物組成和群落結構多樣性的研究方法主要可分為3個層次［7］：一類是基于可培養微生物形態學和營養特征進行分離培養的方法，如平板稀釋涂布法［8］；第2類是基于可培養微生物化學成分差異進行標記的方法，如脂肪酸譜圖法［9］和醌指紋法［10］；另一類是基于微生物DNA的分子生物學技術，如高通量測序法［11］。國內關于香蕉枯萎病病區土壤微生物區系調控主要是通過施肥模式、輪作種植、拮抗微生物及化感植物運用等方面，本文從以上幾方面總結近年來，尤其是近10 年來，關于土壤微生物區系調控及菌群構建防治香蕉枯萎病的理論基礎，為以后開展相關研究提供參考。

1 病區土壤微生物區系特征

現有研究普遍認為，患病地土壤微生物群落及其功能多樣性明顯低于健康土壤。鄧曉等［12］對香蕉枯萎病病區與非病區土壤微生物群落功能多樣性進行了比較研究，發現患病樣地土壤微生物群落功能多樣性明顯低于健康樣地，而患病樣地與健康樣地土壤微生物的優勢碳代謝群落基本相同，均為胺/氨基化合物代謝群和氨基酸代謝群。該研究團隊還進一步研究了土壤理化性質、養分含量和可培養微生物群落結構與香蕉枯萎病之間的關系，結果表明，土壤pH 值是影響蕉園土壤微生物群落結構的主要因素；香蕉枯萎病危害程度中、重度土壤中可培養細菌和放線菌的種類及數量與危害程度輕度和無危害土壤相比均明顯減少，而真菌種類沒有明顯的改變，數量卻明顯增加［13］。陳波等［14］對海南臨高縣3 個地區發病與健康土壤微生物的多樣性進行分析，結果表明，發病蕉園土壤的大部分理化性質指標低于健康蕉園，且發病蕉園的土壤細菌多樣性比健康土壤更豐富。黃永紅等［15］研究了香蕉枯萎病4 號生理小種對香蕉根際土壤微生物和土壤酶活性的影響，結果表明，接種Foc4對香蕉根際土壤微生物總量和細菌數量影響不大，但顯著提高了真菌數量及其在整個微生物中的比例，顯著降低了放線菌數量及其在整個微生物中的比例，細菌與真菌、放線菌與真菌的數量比顯著降低，根際土壤中過氧化氫酶和轉化酶活性顯著升高，這可能是香蕉通過改善其根際微環境來應對病菌侵染的重要自我保護機制。

相比于導病型土壤，抑病型土壤細菌及真菌的生態網絡組織更復雜、網絡節點之間聯系更緊密，抑病型土壤中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌（Gp4）、木霉屬（Trichoderma）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度顯著高于導病型上壤，而鐮刀菌屬（Fusarium）的相對豐度顯著低于導病型上壤［16］。黃珍等［17］研究認為鐮刀菌導致的香蕉枯萎病的生態競爭中，變形菌門存在一定的劣勢而厚壁菌門和放線菌門則能有效繁殖。陳波［6］對發病蕉園和健康蕉園根際土壤微生物群落進行了定性分析，發現病區主要優勢菌為Cy‐tophagasp.、 Bacillus subtilis、 Staphylo‐coccus arlettae與Eubacterium ruminantium；而健康土壤優勢菌為Bacillus subtilis、Bradyrhizobiumsp.、Rhodopseudomonas palus‐tris、Staphylococcus arlettae與Eubacterium ruminantium。

2 施肥模式調控

2.1 有機肥、生物肥和堿性肥料的應用

施肥模式調控土壤微生物區系主要是通過有機肥、生物肥、堿性肥料的施用及其幾種肥料的聯合運用等方面。應用生物有機肥可建立有益菌株改變根際菌群的主導微生物群落［18］，從而促進植物生長，減少病原菌數量或抑制土傳病原菌活性［19］。趙蘭鳳等［20］研究了施用生物復混肥和化肥對香蕉枯萎病及土壤細菌群落多樣性的影響發現，香蕉枯萎病的發生和化肥的施用都降低了土壤細菌群落多樣性，而生物復混肥一定程度上提高了土壤細菌群落多樣性。井濤等［21］研究了菜籽餅、豆餅和花生餅3種餅肥的不同碳氮比發酵液對香蕉枯萎病的防控效果，結果表明，施用餅肥發酵液可以促進植株生長，降低枯萎病病情指數，改變土壤微生物功能多樣性，3 種餅肥發酵基質防病效果以菜籽餅最好，防病效果可達59.60%～67.25%。汪軍等［22］研究了3 種復合微生物肥料對香蕉枯萎病發病率、香蕉生長指標及土壤微生物的影響，結果發現，施用復合微生物肥料不僅提高了對香蕉枯萎病的防治效果，而且對促進香蕉生長和提高根際的生防菌株數量具有較大潛力。李進等［23］研究堿性肥料對土壤微生物活性及其多樣性的影響，認為施用堿性肥料能明顯減少土壤中Foc和真菌數量，增加細菌、放線菌數量，顯著優化土壤微生物種群結構，提高土壤微生物活性及其多樣性，有效抑制病原菌的萌發和致病，從而有效防控香蕉枯萎病。樊小林等［24］利用堿性肥料調節香蕉園土壤酸度防控香蕉枯萎病結果表明，堿性肥料增產的原因在于：一方面提高了土壤pH 值而降低了香蕉枯萎病發病率及其病情指數，減少了香蕉的黃葉數量，使香蕉有較多的綠葉進行光合作用而高產；另一方面香蕉生長期土壤處于中性偏堿環境能有效地抑制尖孢鐮刀菌的萌發和致病，而有利于其他有益微生物的生長，從而為香蕉健康生長營造良好的土壤環境。鐘書堂等［25］連續兩年在連作障礙嚴重的蕉園施用大量生物有機肥，發現其顯著增加了土壤微生物碳量、可培養細菌、芽孢桿菌和放線菌的數量，減少了尖孢鐮刀菌的數量并改良了可培養細菌的組成與群落結構，使連作土壤菌群朝著健康穩定的方向發展。

2.2 有機肥與功能微生物、化肥的聯合作用

有機肥與功能微生物相結合制成微生物有機肥可最大限度的延長拮抗微生物的定殖狀態和存活時間［26］，而生物有機肥與化肥的聯合運用，可以在保障香蕉營養全面供給的同時防控病害。秦艷梅等［27］研究了生物有機肥與氯化鉀和硫酸鉀配施防治香蕉枯萎病的效果，結果發現，生物有機肥與鉀肥配施促進了革蘭氏陽性細菌和放線菌繁殖，而抑制了革蘭氏陰性細菌和真菌生長。匡石滋等［28］研究發現，利用木霉菌和枯草芽胞桿菌與生物有機肥制成藥肥兩用生物有機肥施用能有效改善土壤微生物狀況，增加土壤微生物種群數量，降低病原菌數量，抑制香蕉枯萎病病菌在土壤中的存活與繁殖，同時能提高相關防御性酶的活性，進而提高了植株的抗病性。張志紅等［29］將枯草芽胞桿菌、膠質芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌3種生防細菌與腐熟的有機肥結合，組合成生物復混肥和生物有機肥，結果發現，兩種肥料的施用均引起了土壤微生物群落變化，即真菌數量明顯下降，放線菌明顯升高，細菌變化較小，防病效果分別達61.5%和53.8%。薛超［30］將Bacillus amyloliq‐uefaciens菌株發酵液與有機肥混合制成微生物有機肥后添加到土壤中，成功地在香蕉根際構建了一個有益功能微生物為主導的土壤微生物區系，這為土壤微生物菌群的構建提供了參考。

2.3 有機肥的防病機理

對于有機肥的防病機理，也有學者進行了相關研究。很多研究表明，氨基酸具有促進植物生長和改善土壤理化性質的作用，如劉衛軍［31］研究發現，以氨基酸和多聚類化合物為主要成分的生防制劑能明顯地增加土壤微生物多樣性指數，降低香蕉枯萎病病情指數。趙蘭鳳等［32］也做了相關研究，發現生物有機肥降低了根系分泌物中有機酸的質量濃度，增加了氨基酸的種類和質量濃度，且香蕉枯萎病病情指數與根系分泌物中一些氨基酸質量濃度存在顯著相關性，據此推測這可能是生物有機肥在香蕉枯萎病防治中起作用的原因之一。對于有機肥的最佳施用時期，丁文娟等［33］在大田條件下，研究了生物有機肥的不同施用時期對香蕉枯萎病和土壤微生物的影響，結果發現香蕉營養期施用防病效果最佳，施用生物有機肥顯著降低了香蕉枯萎病的發病率，同時提高了土壤酶活性和增加了有益微生物數量。

3 輪作種植及植物化感調控

3.1 輪作種植運用

連作生物障礙的發生與根際微生態失衡有關。植物長期連作容易引起植物病原微生物的富集和有益微生物數量的減少，土壤微生物區系從細菌主導型向真菌主導型轉化，最終導致土壤微生物組成與群落結構失衡，使病原菌更容易侵染植株而導致植物的各種土傳病害頻發［30］。許多研究證明，每種植物都有自己獨特的根際微生物區系，而這些微生物區系直接或間接地影響其他土壤微生物的發生和發展［34］。所以利用輪作種植可以調控和改良一些土壤微生物區系，從而減輕病害的發生。

現有研究已證實，韭菜、木薯、水稻、生姜、甘蔗以及一些中草藥類，通過粗提液、秸稈還田處理或直接與香蕉輪作的方式可有效減輕香蕉枯萎病的發生［35-37］。如歐陽嫻等［34］研究了香蕉輪作和連作土壤細菌主要類群，發現韭菜輪作地的細菌多樣性更為豐富，并且以擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、綠灣菌門和酸桿菌門為主要類群；而香蕉連作地細菌多樣性有所減少，且出現了明顯的優勢種群，以厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和綠灣菌門為主要菌群。曾莉莎等［38］研究表明，土壤可培養細菌總數隨輪作甘蔗年限的增加而顯著增加，可培養放線菌總數和尖孢鐮刀菌則呈逐漸減少的趨勢，真菌總數無顯著變化，土壤細菌多樣性指數隨輪作甘蔗年限的增加而降低；假單胞菌目（Pseudomonadales）、酸微菌目（Acidi‐microbiales）、浮 霉 菌 目（Planctomycetales）和土壤紅桿菌目（Solirubrobacterales）的細菌豐度隨甘蔗種植年限增加而呈逐年增加的趨勢，并與香蕉枯萎病發病率呈顯著負相關；紅螺菌目（Rhodospirillales）、酸桿菌目（Acidobacte‐riales）和軍團菌目（Legionellales）的細菌豐度則呈隨甘蔗種植年限逐年降低趨勢，并與香蕉枯萎病發病率呈顯著正相關。柳紅娟等［39］發現，木薯與香蕉輪作可顯著降低總真菌數量、病原菌數量和枯萎病的發生率，顯著增加可培養放線菌數量、總細菌的數量、可培養微生物的B/F值和A/F值及總B/F值。

3.2 植物化感運用

植物粗提取液作為潛在的植物源生物農藥在植物病害的防控中有廣泛的應用。前人研究結果顯示，部分植物粗提取液可有效抑制真菌及細菌的生長［40］，這種作用機制稱之為植物的化感作用。漆艷香等［41］研究了油麥菜和向日葵全株水提液對香蕉枯萎病及土壤中微生物的影響，發現向日葵和油麥菜處理均能顯著提高土壤中細菌數量，顯著減少放線菌、Foc4和普通真菌數量，且防病效果與土壤中Foc4及普通真菌呈顯著正相關，與細菌及放線菌則呈顯著負相關。楊江舟等［42］研究了韭菜根系浸提液對香蕉枯萎病和土壤微生態的影響，認為韭菜根系浸提液能夠提高土壤微生物對碳源的利用能力和土壤微生物群落的多樣性、豐富度、均勻度，從而減少香蕉枯萎病的發生。穆雷等［43］利用韭菜、大蒜、大蔥、洋蔥等4 種蔥科植物的組織粗提液進行Foc拮抗試驗發現，韭菜的抑菌效果最佳，其次為大蒜和大蔥，與對照相比都達到了差異極顯著水平，但洋蔥粗提液的抑菌效果不明顯。柳紅娟等［44］研究發現木薯莖葉還田能顯著增加土壤中可培養放線菌、總細菌數量，顯著降低可培養真菌、總真菌及香蕉枯萎病菌的數量，增加可培養微生物的B/F值和A/F值。

4 拮抗菌調控

已報道的對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的拮抗細菌主要包括熒光假單胞菌（Pseudomonas flu‐orescens）、粘質沙雷氏菌（Serratia marce‐scens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、莢殼伯克氏菌（Burkholderia glume）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）等；拮抗真菌有哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、非致病性F. oxys‐porum菌株、無孢菌群真菌等［45］。而關于運用拮抗菌調控土壤微生物區系，李琳［46］研究了解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） AiL3 菌株對香蕉根際及根內微生物種群的影響，生防菌AiL3 施入大田后，通過平板計數法分析得出，AiL3 菌株主要影響香蕉根際土壤微生物的數量，對根內生微生物的數量影響不大；而PCR-DGGE 技術分析結果顯示，菌株處理后田間香蕉根內生微生物群落結構有較大的變化，孕蕾期根部內生細菌的種類減少，而對香蕉根際土壤微生物的種類無顯著影響。樊勝南等［47］研究了枯草芽孢桿菌TR21 可濕性粉劑施用對香蕉根際土壤微生物的影響發現隨著時間的推移，處理和對照根際土壤微生物豐度值都逐漸升高，多樣性指數值逐漸降低，但處理的根際土壤物種豐度值一直都大于對照。漆艷香等［41］研究了洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burk‐holderia cepacia，TY） 和 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌（Bacillus amyloliquefaciens，DF）對香蕉枯萎病的防效及土壤中微生物群落的影響，發現二者均能顯著提高土壤中細菌數量，顯著減少放線菌、Foc4 和普通真菌數量。杜嬋娟等［48］研究了木霉制劑對土壤微生物數量和香蕉枯萎病的影響，結果表明，蕉園施入木霉制劑后，香蕉根圍土壤中真菌的數量顯著提高，枯萎病的發病率明顯降低，處理區最高防效達63.5%。

5 抗性品種調控

抗病品種培育被認為是最有效的防控香蕉枯萎病的手段之一［49］，近年來眾多研究人員對不同品種對香蕉枯萎病的抗性進行了大量評價研究［50-52］，也篩選出了較多抗性較好的品種，如南天黃［53］、粉雜1 號［54］、GCTCV-119［55］等。而對于抗病品種的抗性機理，其對土壤微生態環境的影響，田丹丹等［56］從根系分泌物的角度出發，分析了不同香蕉品種的抗性機理，初步推測抗性品種的根系分泌物吸引了更多有益微生物到香蕉根際，這些有益微生物通過拮抗作用、重寄生作用、競爭作用、促生作用和誘導抗性等機制來抵抗香蕉枯萎病病原菌。張曼等［7］對不同品種的土壤微生物區系群落結構和多樣性進行了探究，結果發現抗病品種真菌豐富度低于感病品種，細菌豐富度和多樣性髙于感病品種；在真菌水平上，抗病品種根際和土壤環境中接合菌門（Zygomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度較高，子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度較低；在細菌水平上，抗病品種根際和土壤環境中擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度較高，纖維桿菌門（Fibrobacteres）和綠彎菌門（Chlo‐roflexi）相對豐度較低；而抗病品種的土體和根際鐮刀菌均和感病品種沒有顯著差異。鄧曉等［57］研究了不同感病級別植株土壤微生物區系特征，結果表明，根際與非根際土壤中可培養真菌、細菌、放線菌的數量和種類均從感病級別高、感病級別低到健康植株持續增加，而病原菌數量從感病級別高、感病級別低到健康植株持續降低。韓李菲［58］研究發現，抗病品種土壤中可培養細菌和放線菌的數量基本上比感病品種多，而感病品種根系土壤中病原菌Foc 的數量基本顯著高于抗病品種。

6 其他調控

土壤微生物區系的調控還包括土壤熏蒸、灌溉水消毒處理等措施。鐘書堂等［25］研究了氨水、石灰碳銨熏蒸土壤對土壤微生物群落的影響，結果表明兩種熏蒸劑對土壤中可培養總細菌和總真菌均有殺滅效果，隨著用量的增加，總真菌數量下降幅度顯著高于總細菌；同時濃度篩選試驗發現，2.67 mL/kg 氨水和（3.33±1.67）g/kg 石灰碳銨聯用既能有效殺滅尖孢鐮刀菌，又能夠最大維持微生物區系穩定性，為香蕉土壤熏蒸的最適用量。王一鳴等［59］也做了相關研究發現，石灰聯合碳銨土壤熏蒸處理明顯改變了香蕉根際微生物群落結構，即顯著降低變形菌門和子囊菌門相對豐度，顯著增加放線菌門相對豐度；同時顯著降低鐮刀菌屬相對豐度，并且顯著提高了土壤中部分拮抗菌的相對豐度，如鏈霉菌屬、紅球菌屬和曲霉屬，最終有效防控香蕉枯萎病的發生并促進其植株生長。劉珊珊等［60］利用灌溉水消毒研究了其對香蕉植株生長和可培養微生物數量的影響，發現灌溉水消毒改變了香蕉根際可培養微生物群落結構，能夠顯著減緩病原菌在土壤中傳播和在香蕉根際的富集。此外，江琳琳［61］開展了不同酸堿度土壤中施加生物炭梯度試驗，結果發現生物炭能夠提高土壤微生物豐度和多樣性，改變土壤細菌種群分布，進而影響土壤微生物的碳源代謝特征，引發土壤系統功能的改變。葉文雨等［62］研究了巨菌草和綠洲一號兩種菌草的根際土壤細菌群落多樣性發現，2 種菌草的根際土壤細菌群落的多樣性與豐富度均略高于非根際土壤，且綠洲一號根際土壤細菌群落多樣性略高于巨菌草，并據此推論不同植物根系對根際土壤細菌群落影響不同，根系分泌物是影響根際細菌群落的重要因素。筆者思考，生物炭調控和菌草運用在香蕉枯萎病的土壤微生防技術探索中是否具有可借鑒性呢？總之，這些土壤微生境的調控方式均為土壤微生物區系調控與構建防治香蕉枯萎病提供了新的思路和依據。

7 展望

土壤健康是指在生態系統界限內維持生物生產力、環境質量和促進動植物健康的土壤功能運行能力［63］，而利用微生物及其代謝產物、植物提取物等生物農藥防治植物病害，使用對生態環境無害的生防菌劑替代化學農藥已成為世界范圍內的研究發展方向［64］。所以試圖利用基于土壤微生物區系調控的生防方案，從土壤酶活性和土壤微生物組成與群落結構調控的角度防治香蕉枯萎病具有可行性，我國學者通過對香蕉枯萎病病區土壤微生物區系特征研究，同時利用拮抗菌、有機肥、植物提取物等嘗試調控土壤微生物生境朝著促進有益菌共生和抑制病原菌繁殖的目標轉變，構建穩定健康的土壤微生態區系，取得了較多理論基礎。但由于土壤微生態環境的復雜性和地域的多變性，國內外關于尖孢鐮刀菌枯萎病抑病型土壤的研究均不夠深入，且推進緩慢［65］。

現階段，關于生防菌的研究主要集中于平板對峙試驗階段，對大田應用的可行性和防效評估研究較少。生防菌劑為活孢子制劑，大田應用受到田間溫度、濕度、pH、土壤微生物、化學農藥等因素的干擾［66］。因此應調控適合生防菌生長的土壤環境，提高其在土壤中的營養利用率和定殖水平，使其快速占據生態位點和分泌能有效抑制病原菌的代謝產物，從而降低土壤中尖孢鐮刀菌數量，這是控制香蕉枯萎病的有效途徑［22］。此外，單一拮抗菌株的防治效果不穩定，所以，應加強對現有拮抗菌聯合運用研究，即通過平板對峙試驗及在大田應用中篩選出能夠共生增效的拮抗菌群體系［67］，如Rajeswari P 等［68］比較了綠木霉+熒光假單胞菌（1%＋2%）、哈茨木霉+熒光假單胞菌（1.5%＋2%）和綠木霉＋哈茨木霉（1%＋1.5%）3個組合對Foc的抑制效果發現，綠木霉＋熒光假單胞菌的組合顯著優于另外兩個組合，這就為開展拮抗菌的聯合運用提供了很好借鑒。再者，現有研究中，對輪作作物的研究缺乏經濟效益評估，選擇輪作的作物除考慮防病效果外，應充分考慮土壤養分利用狀況、投入產出比等［69-70］；植物化感作用的研究往往局限于在培養基中添加某種植物提取物，研究其對病原菌的熒光猝滅率，缺乏田間應用技術研發。

最后，土壤微生物區系調控及其菌群構建為香蕉枯萎病的防控提供了新的思路，但土壤微生態壞境的調控需要栽培、植保、育種等措施來干預，要在香蕉枯萎病生防技術上不斷取得突破，或許不能僅通過某一單一防治方法來實現，而應該是多種途徑的結合應用。如柳影［71］等研究發現，施用生物有機肥聯合韭菜套作對枯萎病的防效為45.2%明顯高于單獨運用生物有機肥的18.7%和單獨運用韭菜套作的13.6%。李虹等［72］研究發現，香蕉與豆科植物間作，同時施加鈣鎂調理劑、微生物菌肥和有機肥，提高了土壤pH，增加了土壤中細菌數量，并抑制了鐮刀菌和真菌群落數量，這都是生防技術聯合運用的成功探索。對于土壤微生物菌群的調控與構建方向，Schippers B 等［73］研究表明，健康土壤中細菌占主要地位，放線菌能通過分泌抗生素來減緩其他菌的生長，真菌大部分是病原菌，而對于香蕉枯萎病的防治，香蕉根際土壤微生物菌群的構建是否完全符合這一論點，還有待更多研究加以補充。但基于土壤微生態菌群健康穩定區系的構建和生防技術研發或將是實現香蕉枯萎病可持續治理的有效途徑。