水凝膠在軟骨組織工程中的設計與應用進展

易鵬綜述 邱波審校

軟骨缺損的修復、再生是醫學研究難題和熱點之一，組織工程已成為軟骨和骨組織重建和再生最常用的方法之一[1]。組織工程主要有2種方法再生缺損的骨軟骨界面和全層軟骨。一種是開發人造軟骨以模擬天然軟骨組織的結構特征、機械特性，從而模擬其生物功能。然而，模擬組織和結構高度復雜的關節軟骨和骨軟骨界面組織的獨特生物功能仍然是一個挑戰。另一種為再生醫學，即提供適當的生物材料作為人工細胞外基質，以促進缺損部位的細胞生長、增殖和分化，利用細胞和生物分子之間相互作用的天然生物過程促進關節軟骨和軟骨下骨的再生[2]。

水凝膠是用于組織工程中一種多功能的生物材料，具有與天然細胞外基質(extracellular matrix，ECM)相似的獨特性質。理想的水凝膠支架應該具備良好的生物相容性、生物降解性、機械性能、細胞黏附性，合適的支架孔徑、孔隙率，容易制造和可注射微創治療等特點。但迄今為止尚未研究出一種理想的水凝膠支架?，F就水凝膠的材料選擇、性質優化及水凝膠支架設計的最新進展進行綜述。

1 水凝膠材料概述

1.1 天然生物材料 天然材料含量豐富，由天然聚合物制成的水凝膠通常具有良好的生物相容性、生物降解性和低免疫反應性。用于制備水凝膠支架的天然材料主要包括蛋白質類如膠原蛋白、明膠和絲素蛋白，多糖類如海藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖、透明質酸和結冷膠等。

膠原蛋白是細胞外基質中最豐富的結構蛋白成分，約90%的關節軟骨干重是Ⅱ型膠原。膠原蛋白具有優異的生物學特性，但其機械性能較差[3]。明膠是膠原蛋白的水解產物，由許多促進細胞黏附的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)序列和促進細胞重塑的基質金屬蛋白酶(MMP)靶序列組成。明膠溶液可以在低溫(<30°C)條件下自凝膠化形成物理交聯水凝膠或通過化學反應形成化學交聯水凝膠[4]。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，由于其強大的機械性能，優異的生物相容性，緩慢的降解性和豐富的供應來源，已成為組織工程應用的新型生物材料[5]。

藻酸鹽是天然存在的多糖聚合物之一，通常從棕色海藻和各種細菌中獲得。藻酸鹽的一個獨特性質是能夠在室溫下通過二價陽離子如Ca2+進行物理交聯[6]。瓊脂糖是一種海藻多糖，具有優異生物相容性和生物力學性質。殼聚糖是一種線性多糖，衍生自天然幾丁質，由葡糖胺和N-乙酰葡糖胺組成。殼聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，其獨特的細胞黏附性在水凝膠設計中發揮重要作用。透明質酸由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的二糖單元組成的線性多糖，其較弱的機械性能、較高的膨脹性能、光滑表面結構及不抗酶解等制約了其在組織工程學上的應用。結冷膠是一種線性陰離子多糖，由四糖重復單元組成。結冷膠水凝膠具有獨特的可注射性，其凝膠化過程可以通過溫度變化和陽離子的存在來調節，而無需復雜的化學交聯劑[7]。

1.2 人工合成材料 雖然天然生物材料制備的水凝膠對軟骨形成、細胞生長、增殖和表型維持顯示出優異的生物相容性，但較弱的機械性質和不受控制的降解性限制了它們在軟骨組織工程中的應用。用于制備水凝膠支架的人工合成材料主要包括無機高分子材料如β-磷酸三鈣和有機高分子材料如聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)和聚羥基乙酸(PGA)及它們的共聚物等。人工合成材料制成的水凝膠由于其化學結構和分子組成便于調節，表現出高度可調的生物降解性和機械性質等。

2 水凝膠特性

2.1 生物相容性 通常合成生物材料的生物相容性比較差，該問題最常見的解決策略是改變合成生物材料的性質或與天然生物材料組合。此外，通過交聯或者改變材料本身的性質也能夠改善支架生物相容性，如利用聚合物上的共軛方式或離子電荷[8]。研究發現，陽離子的存在會對水凝膠的生物相容性產生不利影響，用負電荷可以增強D-寡肽水凝膠的生物相容性[9]。將膠原—殼聚糖多孔支架與γ-輻射和碳二亞胺(CAR)交聯，利用靜電紡絲技術制備殼聚糖—明膠復合支架也可以提高支架的生物相容性[10]。

支架材料的生物相容性越來越受到重視，因為支架最終需與臨床結合，無論是體外培養細胞或者植入人體內，支架性質必須有效且安全。設計出完美的生物相容性支架是實現有效組織工程的最終目標。

2.2 生物降解性 生物降解是指材料在生物體內通過溶解、酶解、細胞吞噬等作用，在組織長入的過程中不斷從體內排出，修復后的組織完全替代植入材料的位置，而材料在體內不存在殘留的性質?？刂扑z的生物降解性以匹配細胞生長和組織修復的速率對于合理設計水凝膠至關重要。研究發現降解過快可能導致ECM蛋白的保留減少，而降解過慢會阻礙細胞重塑，從而阻礙組織的形成，具有平衡生物降解速率的水凝膠能夠促進細胞新軟骨的形成，并在長期培養后獲得更高的機械性能[11]。

2.3 機械性能 水凝膠具有宏觀和微觀水平的機械性質。在宏觀上支架必須承受負荷，以在組織形成時為組織提供穩定性并實現維持其體積的功能。在微觀上，黏附在基質上的細胞能夠感知機械刺激，從而以類似生化信號的方式調節許多重要的生理過程。因此，支架必須能夠承受特定的負荷并以適當的方式將它們傳遞給周圍的細胞和組織。Wang等[12]將軟骨細胞植入明膠—羥苯基丙酸(Gtn-HPA)水凝膠進行體外和體內培養，結果表明，水凝膠剛度可以調節軟骨細胞的功能，影響硫酸化糖胺聚糖的產生、Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因表達，合適的機械性能更好地維持軟骨細胞表型和更高程度的透明樣軟骨修復。將水凝膠剛度納入軟骨組織工程支架的設計變量是控制軟骨細胞增殖和產生細胞外基質的簡單且有效的手段。

2.4 支架結構 合適的孔徑可以促進細胞穿透和遷移、營養物擴散和代謝物質去除，并提供誘導細胞組裝和分化的3D微環境。多孔結構對于支架與周圍環境之間的物質交換是必需的，其能模仿天然軟骨的結構，此外還能允許周圍組織向內生長進入構建體，從而使構建體與天然組織整合。

2.5 細胞黏附性 良好的細胞黏附性可以促進軟骨細胞或間充質干細胞的附著、增殖、分化。細胞黏附參與調節細胞分化、細胞周期、細胞遷移和細胞存活。細胞與底物的親和力是水凝及支架設計和開發中的重要考慮因素。引入天然多糖、無機納米粒子或者細胞黏附肽均可以有效增強水凝膠的細胞黏附性。

2.6 可注射性 水凝膠的可注射性已經吸引了軟骨組織工程應用的廣泛關注，因為可注射水凝膠能夠用微創注入法注入手術部位，并且形成任何期望的形狀，以匹配不規則的軟骨缺陷。制備可注射水凝膠可以使用物理方法或化學方法。物理水凝膠可響應溫度，pH或離子濃度的變化，化學水凝膠可通過各種化學過程形成，例如酶交聯、Schiff堿交聯、Michael加成、點擊化學和光交聯等。

3 水凝膠特性在軟骨組織工程中的應用

軟骨組織工程學是工程學與生物醫學尤其是細胞生物學相結合的邊緣科學，它涉及細胞、支架材料和包括多種生長因子在內的發育環境3種基本要素。

組織工程軟骨的構建需要具備3個主要條件：(1)足夠數量、功水凝膠特性能正常的種子細胞;(2)合適的細胞支架;(3)調節細胞增殖、保持細胞表型特征的細胞因子 。

為改善人工合成材料的生物相容性，倪茂君等[13]采用輻射交聯與凍融循環相結合的方法，將膠原引入聚乙烯醇(PVA)/聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)水凝膠制成復合水凝膠支架，其具有均勻分布的三維多孔結構,膠原的添加增大水凝膠網絡空間結構，顯示出體外細胞存活率的提高。Sheu等[14]開發出一種氧化透明質酸/白藜蘆醇(Oxi-HA/Res)水凝膠，相比于氧化透明質酸(Oxi-HA)水凝膠，其軟骨細胞活力更強，細胞毒性顯著減小，優異的生物相容性能維持軟骨細胞表型、增強ECM合成，并促進聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的基因表達。

水凝膠的生物降解性必須匹配細胞生長和組織修復的速率，如果水凝膠降解太慢，則新組織生長受阻，而降解過快，則可能完全喪失機械完整性。Lalitha等[15]利用計算建模研究了可降解水凝膠構建體的動力學，結果顯示，通過利用聚合物交聯密度和細胞分布的空間異質性，可水解降解的水凝膠可以有效地促進新組織生長。朱飛燕等[16]利用羥乙基脫乙酰殼多糖(GC)/二醛基聚乙二醇(OHC-PEG-CHO)水凝膠研究其降解性能，研究結果證明其降解速率與水凝膠組分濃度有關。過去還有大量研究證實材料的氧化度、濃度、不同組分的配比等均可以用來調節水凝膠的降解特性，未來的研究有必要進一步優化水凝膠配方，并達到針對涉及不同靶向組織的特定應用而設計的最佳降解速率。

水凝膠支架應具有高拉伸和壓縮強度，低摩擦系數，可以促進軟骨細胞定植和增殖，合成健康的新基質。為了提高水凝膠的機械性質，Shin等[17]將甲基丙烯酸化的結冷膠和明膠進行兩步光交聯組成雙網絡(DN)水凝膠，其表現出高達6.9 MPa的壓縮破壞應力，接近軟骨的強度。與單網絡(SN)水凝膠相比，雙網絡水凝膠表現出更強的接近軟骨的機械強度，但是其細胞相容性較差，因此，他們將硬結冷膠微凝膠摻入柔軟和富有延展性的明膠水凝膠中制備出微凝膠增強(MR)水凝膠[18]，它們具有更好的機械強度和生物學性質。Coutinho等[19]研究了交聯方式對甲基丙烯酸化的結冷膠水凝膠機械性質的影響，發現物理交聯方法(溫度和陽離子)與化學交聯方法(光交聯)的結合使結冷膠水凝膠具有高度可調的物理和機械性能，而不影響它們的生物相容性。提示可以組合生理學上相容的交聯方法來開發適用于組織工程應用的可調節機械性能水凝膠。Erickson等[20]將低密度和高密度的間充質干細胞(MSC)分別封裝在1%、3%和5%(w/v)透明質酸水凝膠中培養，并測定構建體的機械性質和生化分析，結果顯示在體外培養9周后，接種高密度MSC的透明質酸水凝膠構建體在動態培養條件下達到1 MPa的壓縮模量。動態培養條件確保了間充質干細胞獲得最佳營養途徑，硫酸化糖胺聚糖和膠原蛋白的形成量比在靜態培養中高30%和29%。證實細胞接種密度和培養方式可以改善水凝膠支架的機械性能，更利于基質的沉積。

支架孔徑大小在軟骨組織工程中的應用存在許多爭議，諸多研究結果認為支架孔徑與細胞增殖呈正相關，但有研究顯示培養期開始時小孔徑的支架中細胞數目的相對增加最大，而在培養期結束時，大孔徑的支架有利于細胞增殖，提示在體外軟骨組織工程的最初步驟中，小支架孔徑和低孔隙率的組合是促進軟骨形成的有效策略。Nava等[21]利用溶劑澆鑄或顆粒浸出技術制造出具有不同孔徑和孔隙度的聚乳酸—三亞甲基碳酸酯支架并接種初級牛關節軟骨細胞，培養2周，結果顯示隨著支架孔徑和孔隙率的增加，細胞密度顯著增加，與其他學者的研究結果基本一致，這些研究認為，細胞數量、DNA含量、GAG和Ⅱ型膠原含量均隨支架孔徑和孔隙率的增加而增加。然而Nava等[21]和Stenhamre等[22]的結果還發現隨支架孔徑增加，細胞代謝活性和細胞外基質的合成均顯著降低。結果的差異性可能是由于3D培養因素的復雜性，這可能會影響細胞滲透、分配和養分擴散，還可能與支架使用的材料有關。一種比較合理的解釋認為支架的大孔徑具有較好的營養供應、氣體擴散和代謝廢物消除特點，但也會使細胞附著和細胞內信號傳導減弱，而小孔與此恰恰相反。近期研究通過結合熱致相分離技術和淋鹽技術成功制備出具有分層纖維和孔徑結構的聚乳酸—脫乙酰殼聚糖復合支架，該支架為大孔和微孔高度互連的結構且具有高孔隙率，測試表明這種分層的微觀結構不僅有利于蛋白質吸附和細胞黏附增殖，還可改善機械性能和支架完整性，顯示出應用于軟骨組織工程的前景。

聚乙烯醇(PVA)具有優良的生物相容性、機械強度和韌性，被廣泛用于生物醫學[23]，然而由于其固有的細胞非黏性限制了細胞生長和與外周組織的整合，研究者采用各種方法來改善其細胞黏附性，Hou等[24]研究了天然多糖和無機納米粒子對非黏性PVA水凝膠細胞黏附和生長的協同作用[25-26]。結果證實，Fe2O3和羥基磷灰石(nHAP)納米顆粒對增強聚乙烯醇水凝膠細胞黏附性具有協同作用，透明質酸(HA)和硫酸軟骨素(CS)組合比單一HA或CS顯著增強PVA水凝膠軟骨細胞黏附和增殖，同時磁性復合納米顆粒和多糖在增加軟骨細胞黏附和增殖方面也具有協同作用。天然多糖和磁性PVA的復合水凝膠在軟骨組織工程的應用中具有巨大潛力。此外，將細胞黏附肽引入水凝膠支架也是一種有效的方法，諸多文獻證實，細胞與ECM之間的相互作用對于生物系統是必不可少的，而各種ECM分子含有特定的肽序列，使其能夠直接與細胞表面受體結合，最佳序列之一是首先在纖連蛋白中發現的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸序列(RGD)，Re'em等[27]將RGD肽固定在大孔藻酸鹽支架上，結果顯示支架表現出增強的細胞黏附性，促進了細胞的增殖。

PNIPAAm是一種衍生自聚丙烯酸的反向溫度敏感聚合物，在約32℃的臨界溶解溫度下具有快速相變，Ren等[28]通過原子轉移自由基聚合(ATRP)將PNIPAAm與明膠復合，形成在生理溫度下產生溶膠—凝膠轉變的可注射水凝膠。此外還有離子敏感、應力敏感、pH敏感等多種物理方法可以改變水凝膠的可注射性。Cheng等[29]利用殼聚糖的氨基官能團與葡聚糖醛的醛基在水溶液中的Schiff反應也可制備出可注射的羧甲基殼聚糖—葡聚糖醛(CMC-DA)復合水凝膠?？勺⑸渌z更容易填充缺損位點，牢固地附著并與周圍天然軟骨組織整合，Chen等[30]在辣根過氧化物酶(HRP)和過氧化氫(H2O2)的作用下通過酶促交聯得到羧甲基支鏈淀粉—酪胺(CMP-TA)和硫酸軟骨素—酪胺(CS-TA)綴合物的可注射水凝膠，結果顯示軟骨細胞的生存和增殖等細胞功能,Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖的表達水平及合成細胞外基質的積累均顯著增強。水凝膠良好的可注射性將極大地推動其在軟骨組織工程中的應用。

4 小 結

雖然在水凝膠材料選擇和制作研究上已取得很大進展，但仍未能制造出一種具有最佳性質的水凝膠實現軟骨組織再生。其面臨許多問題有待解決，例如，如何將這些方法結合在一種水凝膠支架中？結合這些不同的方法是否會產生沖突？如何設計合理可行的個體化支架以實現可調控范圍內性質的最優化？此外，軟骨組織工程要重建的是具有復雜生理功能的軟骨組織，因此必須形成足夠的Ⅱ型膠原蛋白，蛋白聚糖和其他細胞外基質成分，這需要大量軟骨細胞來產生足夠的ECM，而軟骨細胞增殖非常緩慢，在長時間的擴張期間，它們很容易失去其表型并去分化為成纖維細胞[31]。這些問題與挑戰也將是未來軟骨組織工程研究的方向。