n-3多不飽和脂肪酸對大鼠酒精性脂肪肝炎性反應及肝纖維化的影響

沈云海，付明生，劉秀平，馮潔，潘勤聰

酒精性脂肪肝是由長期大量飲酒引起的肝臟疾病，其組織學特征為肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積，可逐步發(fā)展為酒精性肝炎、肝硬化，表現(xiàn)為肝臟內(nèi)炎性反應過度激活及纖維化的加劇[1]。在臨床實踐中，治療酒精性脂肪肝的關鍵在于減輕炎性反應的激活、延緩肝纖維化的進程并最大限度地預防肝硬化的發(fā)生[2]。近年來關于肝炎及肝纖維化的研究認為，Toll樣受體4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路在炎性反應及組織纖維化中起到關鍵調(diào)控作用，該通路激活后NF-κB向細胞核內(nèi)移位并調(diào)控TNF-α、MCP-1和IL-1等多種細胞因子的表達[3-4]，炎性細胞因子的表達能夠激活炎性反應，進而通過肝星狀細胞活化、TGF-β1的大量分泌來引起細胞外基質(zhì)異常的合成和降解，進而逐步形成組織纖維化[5-6]。n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)及n-6 PUFA是體內(nèi)參與花生四烯酸代謝的前體物質(zhì)，研究認為[7]，n-3PUFA代謝過程的副產(chǎn)物具有抗炎活性，而n-6 PUFA代謝過程中的產(chǎn)物具有促炎活性，適當使用n-3 PUFA能在多種疾病的病理進程中起到改善作用。喻日成等[8]關于非酒精性脂肪肝的動物實驗研究證實，n-3PUFA能夠改善非酒精性脂肪肝模型大鼠的脂代謝及炎性反應，但n-3PUFA在酒精性脂肪肝中的應用價值尚不明確。為此，本研究通過分析n-3PUFA對大鼠酒精性脂肪肝炎性反應、肝纖維化的影響及具體機制，旨在為臨床酒精性脂肪肝的治療提供新思路，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量160～200 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，許可證SCXK(滬)2014-0007；n-3PUFA、TLR4激動劑內(nèi)毒素(LPS)購自Sigma公司，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海西唐公司，超純RNA提取試劑盒、SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑盒購自北京康為世紀公司。熒光定量PCR儀購自Bio-rad公司，酶標儀購自Bio-tek公司，高速冷凍離心機購自Hettich公司。

1.2 動物分組及實驗方法 40只SD大鼠編號后按照隨機數(shù)表法分為對照組、模型組、n-3PUFA組、n-3PUFA+LPS組，每組各10只。模型組、n-3PUFA組、n-3PUFA+LPS組3組大鼠參照文獻[9]的研究建立酒精性脂肪肝模型，具體如下：給予40%酒精15 ml·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)8周；n-3PUFA組在酒精灌胃過程中給予n-3PUFA干預，即在飼料中加入劑量為1.0 g/d的n-3PUFA；n-3PUFA+LPS組在酒精灌胃過程中給予n-3PUFA及LPS干預，n-3PUFA干預方式同n-3PUFA組，同時給予1.0 g/d LPS尾靜脈注射。對照組給予正常飼料及每日生理鹽水灌胃。動物實驗第8周后處死各組大鼠進行相關指標檢測。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 肝臟中炎性因子基因表達的檢測：第8周后，處死各組大鼠并剖檢各動物肝臟，采用超純RNA提取試劑盒分離肝臟中的RNA，采用SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用UltraSYBR Mixture試劑盒對cDNA中的TLR4、NF-κB、TNF-α、MCP-1和IL-1進行擴增反應，反應體系如下，cDNA反應混合液10 μl、上下游引物各0.4 μl、去離子水8.2 μl，按照95℃ 15 s、60℃ 30 s的程序反應40個循環(huán)，儀器自動生成反應循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，按照2-ΔΔCt公式計算mRNA表達水平。

1.3.2 血清肝纖維化指標的檢測：第8周后，處死大鼠并收集外周血10 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清后采用ELISA試劑盒測定轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、透明質(zhì)酸(HA)和Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)水平，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠干預后的組織學變化 對照組大鼠光鏡下肝細胞大小、形態(tài)正常，細胞邊界清晰，肝竇無擴張；模型組大鼠光鏡下可見彌漫性分布的肝細胞脂肪變性，n-3PUFA組大鼠光鏡下可見肝細胞脂肪變性、但較模型組大鼠減輕；n-3PUFA+LPS組大鼠光鏡下可見肝細胞脂肪變性，但較n-3PUFA組大鼠加重，見圖1。

2.2 4組大鼠肝臟中TLR4和NF-κB基因表達水平比較 模型組大鼠肝臟中TLR4和NF-κB的mRNA表達水平明顯高于對照組，n-3PUFA組大鼠肝臟中TLR4和NF-κB的mRNA表達水平明顯低于模型組，n-3PUFA+LPS組大鼠肝臟中TLR4和NF-κB的mRNA表達水平明顯高于n-3PUFA組，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝臟組織TLR4、NF-κB mRNA表達水平的比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與n-3PUFA組比較，cP<0.05

2.3 4組大鼠肝臟中炎性細胞因子基因表達水平比較 模型組大鼠肝臟中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表達水平明顯高于對照組，n-3PUFA組大鼠肝臟中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表達水平明顯低于模型組，n-3PUFA+LPS組大鼠肝臟中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表達水平明顯高于n-3PUFA組，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4 4組大鼠血清中肝纖維化指標比較 模型組大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明顯高于對照組，n-3PUFA組大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明顯低于模型組，n-3PUFA+LPS組大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明顯高于n-3PUFA組，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠肝臟組織TNF-α、MCP-1、IL-1 mRNA表達水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與n-3PUFA組比較，cP<0.05

表3 各組大鼠血清肝纖維化指標比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與n-3PUFA組比較，cP<0.05

3 討 論

酒精性脂肪肝是長期大量飲酒引起的肝臟疾病，可逐步向酒精性肝炎、酒精性肝硬化發(fā)展，脂肪在肝臟中沉積后引起炎性反應及肝纖維化激活是造成酒精性肝炎及肝硬化發(fā)生的關鍵病理環(huán)節(jié)[10-11]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表達水平均明顯升高。以上結(jié)果說明模型大鼠的肝臟病變特點與酒精性脂肪肝的臨床病理學特征相吻合，肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積且TLR4/NF-κB通路介導的炎性反應明顯激活，模型建立成功。

治療酒精性脂肪肝的關鍵是抑制肝臟內(nèi)持續(xù)激活的炎性反應，n-3PUFA是一類具有抗炎活性的不飽和脂肪酸，參與花生四烯酸代謝的過程并減少具有促炎作用的前列腺素分泌，同時也能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[12-14]。n-3PUFA用于非酒精性脂肪肝的相關研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝大鼠接受n-3PUFA干預后的炎性反應和肝纖維化均得到改善。本研究結(jié)果顯示，n-3PUFA組大鼠肝臟中脂肪變性明顯減輕，TLR4、NF-κB、TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表達水平均明顯低于模型組，表明n-3PUFA能夠抑制酒精性脂肪肝大鼠肝臟內(nèi)TLR4/NF-κB通路分子及下游細胞因子的表達，用于酒精性脂肪肝的治療能夠起到抑制炎性反應激活的作用。

對照組 模型組 n-PUFA-3組 nPUFA-3+LPS組

圖1干預后4組肝臟的病理變化 (HE染色，×200)

TLR4/NF-κB通路下游細胞因子TNF-α、MCP-1和IL-1直接參與炎性反應的調(diào)控。TLR4將細胞外信號向細胞內(nèi)傳遞后，NF-κB與相應的抑制分子I-κB解離，游離的NF-κB移位進入細胞核并啟動TNF-α、MCP-1和IL-1的表達[15-16]。TNF-α和IL-1具有促炎活性，能夠使多種炎性細胞發(fā)生活化并向肝臟組織浸潤[17-18]；MCP-1對單核細胞具有趨化活性，能夠促進單核細胞向肝臟組織趨化運動[19-20]。為了明確n-3 PUFA是否直接通過TLR4/NF-κB通路來抑制肝臟組織中TNF-α、MCP-1和IL-1的表達，本研究在n-3 PUFA干預的同時聯(lián)合使用了TLR4激動劑LPS，結(jié)果顯示，n-3PUFA+LPS組大鼠肝臟中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表達水平均明顯高于n-3PUFA組，表明n-3PUFA抑制TNF-α、MCP-1和IL-1表達的作用被TLR4激動劑LPS所逆轉(zhuǎn)，進而提示，n-3PUFA通過抑制TLR4/NF-κB通路來抑制酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中TNF-α、MCP-1和IL-1的表達。

HA和C-Ⅳ是肝臟基質(zhì)中的主要成分，在肝纖維化的過程中2種成分大量合成，同時造成血清中HA及C-Ⅳ的釋放增多。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明顯高于對照組，提示酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)存在不同程度的肝纖維化。在使用n-3PUFA干預后發(fā)現(xiàn)，n-3PUFA組大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明顯低于模型組；n-3PUFA+LPS組大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明顯高于n-3PUFA組。表明n-3PUFA能夠抑制酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)的肝纖維化過程，且這一抑制作用能夠被TLR4激動劑LPS所逆轉(zhuǎn)。提示n-3PUFA可通過抑制TLR4/NF-κB通路來抑制酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中的纖維化過程。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

沈云海：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;付明生、劉秀平：動物實驗，包括造模、給藥、取材;劉秀平、馮潔：分子生物學實驗，包括PCR及ELISA檢測;潘勤聰：課題設計，論文撰寫