二術解毒湯對二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌前病變的抑制作用及機制研究※

成 揚 陳天陽 張銀華 薛建華 傅益飛 陳建杰

(上海市浦東新區傳染病醫院肝病科，上海 201299；上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所，上海 201203)

根據國際癌癥研究機構的報告，肝癌在男性中每年發生523 000例，占所有癌癥的7.9%，女性中每年發生226 000例，占所有癌癥的6.5%，是全球男性中第五大、女性中第七大常見癌癥[1]。在肝癌的分類中80%為肝細胞癌(HCC)，據統計全球每年有748 300例肝癌新發病例和695 900例死亡病例，其主要危險因素包括病毒感染(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、脂肪性肝病(酒精、代謝和飲食誘導)、自身免疫性肝病或慢性膽汁淤積性肝病等[2-4]。近年來，隨著現代醫療技術的不斷發展以及各種治療策略的綜合運用，HCC的治療手段不斷更新豐富，如非藥物療法(包括手術切除、射頻消融、放化療或肝移植等)、藥物療法[包括索拉非尼(多激酶抑制劑)、卡博替尼(酪氨酸激酶抑制劑)、nivolumab(PD-1抑制劑)]，顯著改善了HCC患者的預后，但總體而言5年生存率仍然不能令人滿意[5-9]，且患者經濟負擔較重，復發率高，顯著降低了患者的生活質量。故積極探索治療肝癌的理想藥物和方法對于肝癌的防治顯得至關重要。

肝癌前病變是一個從量變到質變的過程，是癌變進展中啟動、促進和演變過程的中間階段，此過程是可逆的，因此進一步探究肝癌前病變的基本病理、生理機制，早期采取干預措施則可逆轉或中斷肝癌前病變的病理進程，有效抑制肝癌的發生發展，延長患者壽命，從而帶來較大的經濟效益。目前，針對肝癌前病變仍缺乏理想的治療藥物和手段，而中醫藥在該領域具有獨特的優勢。本研究通過觀察二術解毒湯對大鼠肝癌前病變肝組織中甲胎蛋白(AFP)、細胞角蛋白19(CK19)、原癌基因(c-Myc)、Yes相關蛋白(YAP)及PDZ結合相關性轉錄共激活因子(TAZ)表達的影響，初步探討其分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 62只無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠，體質量為(180±10)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室。

1.2 藥物與試劑 二術解毒湯顆粒(藥物組成：蒼術12 g，炒白術9 g，半枝蓮9 g，白花蛇舌草9 g，丹參12 g，炙鱉甲6 g)委托江陰天江藥業有限公司生產，產品批號：1810332；華蟾素膠囊，陜西東泰制藥有限公司，國藥準字Z20050846；二乙基亞硝胺(DEN)，美國sigma公司；二氨基聯苯胺(DAB)顯色液，美國Cell Signaling Technology公司；蘇木素復染液，生工生物工程(上海)股份有限公司；CK19、AFP、c-Myc抗體，Proteintech中國公司；免疫組化兔二抗，Cell Signaling Technology公司；Trizol試劑盒，美國Invitrogen公司；聚合酶鏈式反應(PCR)引物，美國Invitrogen公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real time-PCR)擴增試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix，Thermo Fisher Scientific公司；cDNA合成(逆轉錄)試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；PCR擴增引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)水，上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 5%CO2培養箱，Thermo Fisher Scientific公司；Excelsior ES全自動組織脫水機，石蠟包埋機，HM340E型石蠟切片機，Thermo Fisher Scientific公司；HD-330型烤片機，天津市惠達實驗儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；Real time-PCR系統，美國Applied Biosystems公司。

1.4 動物分組、造模及干預 62只大鼠適應性飼養7 d后，按照隨機數字表法分為6組，即正常組8只，模型組14只，華蟾素組10只，二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組各10只。參照文獻[10]造模方法，模型組，華蟾素組，二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組予DEN 50 mg/kg腹腔注射，每周2次，連續4周，第5～14周每周1次，14周末結束。正常組予等容積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，14周末結束。造模同時每日9:00華蟾素組予華蟾素0.15 g/kg，二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組分別予0.525、1.05、2.1 g/kg二術解毒湯灌胃干預，正常組、模型組根據體質量予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，至16周末結束。造模過程中模型組，華蟾素組，二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組分別死亡5、3、4、4、4只。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 肝臟、脾臟指數 各組大鼠16周末灌胃結束后禁食12 h，稱質量后用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈采血并處死。取各組大鼠肝臟、脾臟，稱取質量，計算各組大鼠肝臟指數、脾臟指數。肝臟指數=肝濕質量(g)/體質量(g)×100%；脾臟指數=脾濕質量(g)/體質量(g)×100%。

1.5.2 免疫組化法檢測肝組織AFP、CK19、c-Myc表達 參照試劑盒使用說明書，進行免疫組化染色，具體步驟：①石蠟切片制備。將各組癌組織部分和正常組織部分切成1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm的組織塊，放入甲醛溶液里固定24 h，固定好的組織分別在不同濃度的乙醇中進行梯度脫水，然后制備肝組織蠟塊，蠟塊用切片機切成6 μm切片。②石蠟切片脫蠟至水。二甲苯Ⅰ 20 min→二甲苯Ⅱ 20 min→100%乙醇Ⅰ 20 min→100%乙醇Ⅱ 20 min→95%乙醇20 min→90%乙醇20 min→80%乙醇10 min→蒸餾水5 min。③封閉內源性過氧化物酶。新鮮配制的3%H2O210 min→蒸餾水5 min→0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次×5 min。④抗原修復。將切片放入盛有M枸櫞酸鈉修復液中，置微波爐內高火加熱使容器內液體至起氣泡終止(約7 min)，然后低火加熱15 min，室溫自然冷卻30 min，0.01 M PBS漂洗3次×5 min。⑤加封閉液。保濕盒中切片組織表面以10%牛血清白蛋白(BSA)至室溫封閉10 min。⑥加一抗。吸干封閉液，組織樣本上加入稀釋的一抗，保濕盒中4 ℃孵育過夜。⑦加二抗。將切片從4 ℃冰箱中取出，0.01 M PBS漂洗3次×5 min，滴加與一抗相對應的二抗，4 ℃保濕盒中孵育30 min，0.01 M PBS漂洗3次×5 min。⑧DAB顯色。1 mL A液中加入30 μL B液，混勻后滴加到組織樣本上，顯色時間一般為1～5 min，肉眼或者在顯微鏡下控制發色程度，適時終止反應，使用自來水沖洗10 min。⑨蘇木素輕度復染。加蘇木素1～2 min，自來水終止反應。⑩脫水。75%乙醇15 min→85%乙醇15 min→95%乙醇15 min→100%乙醇Ⅰ 15 min→100%乙醇Ⅱ 15 min→二甲苯Ⅰ 15 min→二甲苯Ⅱ 15 min。封片。用中性樹膠封片，鏡檢。免疫組化結果的判讀：每個標本隨機取5個高倍鏡視野(×400倍)基于陽性染色細胞的百分比和染色強度進行評分。參考文獻[11]陽性染色細胞的百分比：0～5%得0分，6%～35%得1分，36%～70%得2分，>70%得3分；染色強度：未染色0分，弱染色1分，中度染色2分，強染色3分。使用兩者相乘得分計算最終評分，評分等級如下：0～1分評為“-”，2～3分評為“+”，4～6分評為“++”，> 6分評為“+++”。評分≥4分為陽性，判讀過程由2位病理醫生獨立進行。

1.5.3 Real time-PCR法檢測肝臟組織中AFP mRNA、CK19 mRNA、c-Myc mRNA、YAP mRNA及TAZ mRNA的表達 (1)Trizol法提取總RNA。①勻漿處理：取少量肝組織置于離心管中，加入Trizol充分研磨，室溫放置5 min，使其充分裂解;②向每個離心管中加入相當于Trizol容積1/5的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩15 s，然后再室溫靜置5 min；③提前預冷4 ℃低溫離心機，然后4 ℃以12 000 r/min離心15 min，離心后將呈現出上層無色水相和下層紅色有機相，RNA存在于上層水相中；④用移液器將上層水相小心吸到一個新的滅菌1.5 mL EP管中，然后加入等容積的異丙醇，輕柔顛倒7～8次混勻后，再室溫靜置5 min；⑤4 ℃低溫離心機以12 000 r/min離心10 min，離心后RNA以白色沉淀物的形式出現在管底； ⑥RNA沉淀的洗滌：去除上清液，然后加入1 mL的95%乙醇洗滌RNA沉淀,輕柔的上下顛倒數次后，以12 000 r/min離心5 min，隨后小心吸除乙醇溶液，置于室溫條件下5～10 min，使得RNA沉淀充分干燥；⑦在RNA沉淀中加入50～100 μL的DEPC水，溶解RNA。(2)逆轉錄合成cDNA。按照以下反應體系加入各成分，5×RT Buffer 4 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，Primer Mix 1 μL，RNA模板4 μL，DEPC水7 μL，加樣后將樣本混勻置于PCR儀，設置反應條件為37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，10 ℃保存。(3)Real time-PCR擴增反應：總體積為20 μL(SYBR Green Master Mix 10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，DNA溶液1 μL，滅菌水7 μL。循環反應體系：預變性 95 ℃ 30 min；變性 95 ℃ 15 s；退火60 ℃ 30 s；延伸70 ℃ 30 s，循環40次。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPHD)為內參基因。目的基因的表達使用2-△△Ct法進行統計。引物序列見表1。引物序列設計公司生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠肝臟指數、脾臟指數比較 見表2。

表2 各組大鼠肝臟、脾臟指數比較

由表2可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝臟指數、脾臟指數均升高(P<0.05)；與模型組比較，華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝臟指數、脾臟指數均降低(P<0.05)。與華蟾素組比較，二術解毒湯顆粒低、高劑量組肝臟指數均升高(P<0.05)，二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組脾臟指數差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠肝組織中AFP表達比較 見表3、后插1圖1。

由表3、圖1可見，與正常組比較，模型組、二術解毒湯顆粒低劑量組肝組織AFP表達陽性率升高(P<0.05)，華蟾素組及二術解毒湯顆粒中、高劑量組肝組織AFP表達陽性率升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝組織AFP表達陽性率降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。與華蟾素組比較，二術解毒湯顆粒低、高劑量組AFP表達陽性率升高，中劑量組AFP表達陽性率降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠肝組織AFP表達比較

2.3 各組大鼠肝組織中CK19表達比較 見表4、后插1圖2。

表4 各組大鼠肝組織CK19表達比較

由表4、圖2可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術解毒湯顆粒低劑量組CK19表達陽性率升高(P<0.05)，二術解毒湯顆粒中、高劑量組CK19表達陽性率升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，二術解毒湯顆粒劑中劑量組CK19表達陽性率降低(P<0.05)，華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、高劑量組也降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與華蟾素組比較，二術解毒湯顆粒中、高劑量組CK19表達陽性率降低，二術解毒湯顆粒低劑量組CK19表達陽性率升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠肝組織中c-Myc表達比較 見表5、后插2圖3。

表5 各組大鼠肝組織中c-Myc表達比較

由表5、圖3可見，與正常組比較，模型組及二術解毒湯顆粒低劑量組c-Myc表達陽性率升高(P<0.05)；華蟾素組及二術解毒湯顆粒中、高劑量組c-Myc表達陽性率升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組c-Myc表達陽性率降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與華蟾素組比較，二術解毒湯顆粒中劑量組c-Myc表達陽性率降低，二術解毒湯顆粒低、高劑量組升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠肝組織AFP mRNA、CK19 mRNA和c-Myc mRNA表達比較 見表6。

表6 各組大鼠肝組織AFP mRNA、CK19 mRNA和c-Myc mRNA表達比較

由表6可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP mRNA、CK19 mRNA及c-Myc mRNA表達水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP mRNA、CK19 mRNA及c-Myc mRNA表達水平均降低(P<0.05)。與二術解毒湯顆粒低劑量組比較，華蟾素組及二術解毒湯顆粒中、高劑量組AFP mRNA、c-Myc mRNA表達水平均降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；華蟾素組及二術解毒湯顆粒中劑量組CK19 mRNA表達水平均降低(P<0.05)。

2.6 各組大鼠肝組織中YAP mRNA、TAZ mRNA表達比較 見表7。

表7 各組大鼠肝組織中YAP mRNA、TAZ mRNA表達比較

由表7可見，與正常組比較，模型組、華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組YAP mRNA、TAZ mRNA表達水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組YAP mRNA表達水平均降低(P<0.05)；華蟾素組及二術解毒湯顆粒中、高劑量組TAZ mRNA表達水平均降低(P<0.05)。與二術解毒湯顆粒低劑量組比較，華蟾素組及二術解毒湯顆粒劑中、高劑量組TAZ mRNA、YAP mRNA水平均降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

肝癌前病變是肝癌發生發展的中間階段，雖其在古代醫學中無相對應的病名，但根據病因病機及臨床表現可歸屬于中醫學“肝著”“肝積”“積聚”等范疇[12]。病名雖然不同，但卻有著共同的病因病機。正氣虧虛不能抵御外邪，導致臟腑功能失調是本病發生的根本。外感濕熱疫毒，留滯機體不去，導致熱毒凝結；內傷飲食勞倦，而致脾胃損傷，運化功能失調，導致痰濕停滯；情志不遂，肝氣不疏，氣機失調，導致脈絡受阻，血行不暢而成瘀血。熱毒、痰濁、瘀血是本病發生的必要條件。發病之初，邪氣壅實，正氣未虛，病機性質多屬實；隨著邪氣入侵，損傷人體正氣，表現為虛實夾雜之證；久之，氣血耗損嚴重，則轉為正虛為主[13]。故熱毒、痰濁、瘀血互結于脅肋，損傷正氣，久之導致肝癌前病變的形成。二術解毒湯方中蒼術燥濕以運脾，白術健脾以燥濕，二術同用補運兼施，則痰濕之邪除，無形之邪亦消；半枝蓮、白花蛇舌草清熱解毒，兩藥相須為用謹防肝內熱毒蘊蒸；丹參活血化瘀，鱉甲軟肝散結，二者合用可達活血化瘀、軟堅散結之效。諸藥合用，共奏扶正祛邪、活血化瘀、軟堅散結之功，則有形之邪除，無形之邪消。本方用藥精簡，在顧護中州、調養后天的基礎上，輔以清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結之品，可防止病情進一步惡化?，F代藥理研究表明，蒼術具有干擾內皮細胞中骨形態發生蛋白(BMP)信號傳導的能力，下調Runx2活化而抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)表達和血管內皮生長因子(VEGF)分泌，從而抑制腫瘤的形成[14]；白術可下調Bcl-2基因表達，而上調P21基因表達，通過增強機體免疫功能而實現抑制H22肝癌小鼠腫瘤的作用[15]；半枝蓮具有抗癌、抗突變、抗炎、抗氧化、增強免疫、抗動脈粥樣硬化、護肝等藥理作用[16-17]，對DEN誘導大鼠實驗性肝癌的形成具有一定的抑制作用,并能改善肝功能的各項指標[18]；白花蛇舌草在體外具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、神經保護、提高免疫力等作用[19]；丹參具有抗肝損傷、抗肝脂肪變性、抗肝纖維化、抗肝硬化和抗HCC等作用[20-22]；鱉甲可抑制轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導的肝星狀細胞(HSC-T6)增殖，降低膠原蛋白Ⅰ、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Jun D和P65蛋白水平，抑制金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)、TIMP-2和TGF-β1/Smad通路，具有抗肝纖維化、抗癌作用[23-24]。

肝癌的發展是遺傳改變的多步驟過程，涉及原癌基因的激活，這導致不受控制的細胞增殖持續增加。c-Myc是一種非常強的原癌基因，參與細胞生長、分化、凋亡，其過表達導致自主細胞增殖，是肝癌發生發展的一個重要刺激因子[25-26]。AFP為診斷HCC生物標志物，其升高對于HCC診斷的敏感性較差，但在預測HCC、生殖細胞腫瘤、轉移性癌癥的發生方面具有重要意義[27-28]。相關研究表明，在HCC患者中AFP陽性與HCC更高的病理分級、更高級的TNM-7分期、更大的腫瘤和更低的存活相關[29]。CK是主要在上皮細胞中表達的中間絲蛋白，由Ⅰ型(CK9-20)和Ⅱ型(CK1-8)細胞角蛋白組成，其在維持上皮屏障、調節先天免疫、細胞內信號傳導、細胞黏附、上皮細胞增殖和分化中起關鍵作用[30]。CK19在正常的肝細胞中不表達，而在多種惡性肝癌組織中過度表達，如在早期肝癌、進展期肝癌中的陽性率分別為16.67%、18.75%，明顯高于非腫瘤性肝組織[31-32]。Cui DJ等[33]研究發現，CK19陽性表達在肝癌惡性進展中起重要作用。

YAP、TAZ是Hippo途徑下游效應分子，兩者是密切相關的旁系同源物，主要通過反饋機制介導Hippo途徑的下游效應[34]。YAP基因位于人類染色體11q22上，具有65kDa的分子量，在整個發育過程中普遍存在于人體組織中；TAZ基因位于人類染色體3q23-q24上，編碼43kDa的蛋白質，除了胸腺和外周血白細胞外，在各種組織中都有豐富的表達[34]。當Hippo途徑失活時，YAP和TAZ將轉移到細胞核，并通過與轉錄因子形成復合物促進下游生長，促進或凋亡抑制基因的轉錄，例如轉錄增強因子(TEF，也稱為TEAD)、runt結構域轉錄因子(Runx)[35]。Hippo通路成分的異常表達還涉及多種疾病的發病機制，如心律失常性心肌病、特發性肺纖維化、多囊腎病、癌癥等[36]。作為Hippo途徑的主要下游效應物，在多種類型的人類癌癥中觀察到升高的YAP和(或)TAZ表達和核定位，包括肝癌、結腸癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌和乳腺癌[37-39]。研究表明，YAP在肝癌組織中較癌旁組織高表達，且與肝硬化、AFP水平、腫瘤大小、分化程度及分期有密切關系，上調TAZ的表達可促進HCC的惡性增殖和轉移。

本研究結果表明，華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組肝臟指數、脾臟指數均低于模型組(P<0.05)；華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP、CK19、c-Myc表達均低于模型組；華蟾素組及二術解毒湯顆粒低、中、高劑量組AFP mRNA、CK19 mRNA、c-Myc mRNA、YAP mRNA、TAZ mRNA表達均低于模型組(P<0.05)。說明二術解毒湯可顯著抑制肝組織中AFP、CK19、c-Myc陽性表達及肝組織中AFP mRNA、CK19 mRNA、c-Myc mRNA、YAP mRNA、TAZ mRNA的表達，對于DEN誘導的大鼠肝癌前病變有顯著的抑制作用，但是這種抑制作用是否與Hippo通路的激活有關，仍需進一步研究。