miR-203a-3p抗彌漫性大B細胞淋巴瘤的作用及機制研究

趙 婷， 劉安生， 王 華

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是一種非霍奇金淋巴瘤，也是一種具有高度侵襲性的淋巴系統彌漫性惡性增生性疾病，存在生發中心B細胞樣和活化B細胞樣兩個主要分子亞型[1-4]。現階段治療DLBCL多采用利妥昔單抗聯合化療，雖然可以有效治療大多數患者，但仍有約1/3的患者存在難治愈和復發的情況[5-6]。因此，有必要進一步了解DLBCL發生的分子機制，確定新分子靶點和治療策略，提高DLBCL患者的預后率。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組長度為18～23個核苷酸的非編碼RNA[7]。越來越多的研究發現，miRNA作為腫瘤的抑制劑或者癌基因參與人類多種不同類型的疾病[8]。有研究報道，miRNA可通過與mRNA 3′-UTR堿基互補配對來調節基因的表達，因此miRNA的失調與腫瘤的發生、轉移和預后密切相關[9-10]。miR-203a-3p在很多腫瘤中已被研究，如在鼻咽癌中，通過抑制LASP1蛋白的表達抑制鼻咽癌細胞的增殖和代謝[11]，在胃癌中下調胰島素樣生長受體-1(insulin like growth factors receptor 1, IGF-1R)抑制腫瘤的增殖[12]。然而，在DLBCL細胞中，miR-203a-3p的生物學作用和機制尚不清楚。FOXP1是FOXP家族成員之一[8]，參與機體的多種生理過程，且過表達于多種腫瘤組織中，與腫瘤的發生發展密切相關[13-15]。本研究擬檢測miR-203a-3p和FOXP1在DLBCL組織中的表達水平，同時探究二者對DLBCL細胞增殖和侵襲的作用，揭示miR-203a-3p和FOXP1在DLBCL發生發展中的作用機制，為DLBCL患者的預后提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織 收集30例DLBCL組織，均經病理證實(根據2008年世界衛生組織的分類)，患者均未接受過相關治療。另取20例淋巴結反應性增生(reactive hyperplasia of lymphnode, RH)組織作為對照。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.1.2細胞 人DLBCL細胞株SU-DHL-4和HBL-1(編號：BNCC 340176和BNCC 341660，上海中國科學院細胞庫)，用含體積分數為10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液培養細胞，培養溫度為37 ℃，二氧化碳的體積分數為5%。

1.1.3試劑 RPMI 1640培養液(批號：R8758，美國Sigma公司)；胎牛血清(南美特級，批號：40130ES76，美國Hyclone公司)；miR-203a-3p模擬物(miR-203a-3p mimic)及其相應的對照物(NC-mimic)(廣州日博生物有限公司)；FOXP1小干擾RNA(si-FOXP1)及其對照物(Scramble)(美國Santa公司)；熒光素酶報告基因質粒(美國Promega公司)；FOXP1過表達質粒(pcDNA-FOXP1)(美國Addgene公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(批號：C0029，碧云天生物技術有限公司)；Wnt1(貨號：ab105740)、β-catenin(貨號：ab6302)、Cyclin D1(貨號：ab134175)及c-Myc(貨號：ab32072)(艾博抗生物科技有限公司)；山羊抗兔二抗(貨號：31402，美國賽默飛科技公司)。

1.1.4儀器 Esco CelSafe CO2培養箱(藝思高生物科技有限公司)；奧林巴斯倒置顯微鏡(CKX53，明美光電技術有限公司)；SpectraMax iD5多功能微孔板讀板(Molecular Devices公司)；流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI StepOne公司)；SDS-PAGE凝膠電泳儀(JX196552JY-JX5，邢臺潤聯科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 將SU-DHL-4和HBL-1細胞接種到24孔板中，待細胞密度達70%時進行轉染。3 μL的Lipofectamine RNAiMAX試劑和1 μL miRNA或siRNA分別稀釋到50 μL無血清的培養液中，混合5 min后，將稀釋好的Lipofectamine RNAiMAX試劑加入稀釋好的miRNA或siRNA中孵育10 min，再加入培養板中孵育24 h。將2.5 μg的pcDNA-FOXP1與空載質粒(Vector)分別與5 μL Lipofectamine RNAiMAX共同混合在125 μL的無血清培養液中，與細胞共孵育。

1.2.2RNA提取和實時定量PCR 組織和細胞總RNA的提取使用TRIzol試劑，按照說明書的要求操作。檢測miRNA采用實時定量聚合酶鏈反應，使用TaqMan微小RNA逆轉錄試劑盒，反轉錄條件：16 ℃ 30 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min。U6為miRNA的內參標準。mRNA檢測采用M-MLV逆轉錄酶，cDNA擴增采用PrimeScript RT Master Mix，反轉錄條件：95 ℃ 10 min，40個循環，95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s。GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt方法計算miR-203a-3p和FOXP1的表達。引物如下：

miR-203a-3p：

正向：5′-GGCGGGCTGAAATGTTTAGGA-3′

反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′

FOXP1：

正向：5′-TCAGTGGTAAC CCTTCCCTTA-3′

反向：5′-GTACAGGATGCACGGCTTG-3′

1.2.3細胞增殖 采用CCK-8試劑評估細胞增殖。收集對數期的細胞接種在96孔板中，并調整細胞密度為每孔3×104個，培養24 h后進行轉染，繼續培養24，48和72 h。培養結束后每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵化2 h后，用微型平板分析儀測定光密度值(OD值)。

1.2.4細胞侵襲 細胞以每孔3×104個接種到24孔板小室，下層添加含10%胎牛血清的培養基。孵育24 h后，仔細去除未遷移的細胞，用體積分數為4%的多聚甲醛固定后，用體積分數為0.1%的結晶紫染色15 min。在顯微鏡下計算5個視野的細胞侵襲數并計算平均值。

1.2.5細胞凋亡 將細胞消化處理后收集到對應的EP管中，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，將5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶在黑暗中加入裝有樣品的EP管中，室溫下孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6熒光素酶報告基因分析 使用microrna.org數據庫預測miR-203a-3p和FOXP1之間的靶向關系。構建野生型FOXP1質粒(WT-FOXP1)和突變型FOXP1質粒(Mut-FOXP1)熒光素酶報告載體，采用脂質體3 000分別將WT-FOXP1和Mut-FOXP1與miR-203a-3p mimic和NC-mimic共轉染，24 h后使用雙熒光素酶測定系統測定熒光素酶活性。

1.2.7免疫印跡 收集細胞并用RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。上樣后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后一抗孵育4 ℃過夜，加二抗室溫孵育2 h，ECL試劑檢測蛋白。

2 結 果

2.1miR-203a-3p在DLBCL組織中的表達水平 與RH組織比較，DLBCL組織中miR-203a-3p的表達水平顯著降低(P<0.01，圖1A)。在SU-DHL-4和HBL-1細胞中，與轉染NC-mimic比較，轉染miR-203a-3p mimic可顯著增加兩種細胞株中miR-203a-3p的表達水平，差別均具有統計學意義(P<0.01，圖1B)。

2.2過表達miR-203a-3p對DLBCL細胞的增殖、侵襲和凋亡的影響 與NC-mimic組比較，過表達miR-203a-3p能夠明顯抑制SU-DHL-4和HBL-1細胞的增殖(P<0.01，圖2A和2B)；Transwell實驗結果顯示，兩種細胞株的相對侵襲細胞數在轉染miR-203a-3p mimic后明顯降低(P<0.01，圖2C)。而凋亡實驗結果顯示，過表達miR-203a-3p可顯著誘導細胞凋亡(P<0.01，圖2D和2E)。

nRH=20； nDLBCL=30. A：qPCR檢測miR-203a-3p 在RH和DLBCL組織中的表達；B：轉染miR-203a-3p mimic后，qPCR檢測轉染效率. 與NC-mimic組比較，△△：P<0.01.圖1 miR-203a-3p在DLBCL組織中的表達水平Fig 1 The expression of miR-203a-3p in DLBCL tissues

2.3FOXP1與miR-203a-3p的關系研究 采用microrna.org數據庫預測到在FOXP1的3′-UTR區域存在與miR-203a-3p的結合位點(圖3A)。熒光素酶報告基因結果顯示，WT-FOXP1質粒和miR-203a-3p mimic共轉染后的熒光強度顯著低于WT-FOXP1質粒和NC-mimic共轉染組(P<0.01，圖3B)，而Mut-FOXP1質粒和miR-203a-3p mimic共轉染后的熒光強度與Mut-FOXP1質粒和NC-mimic共轉染后無明顯區別。DLBCL患者組織中FOXP1的表達水平顯著高于RH組(P<0.01，圖3C和3D)，SU-DHL-4和HBL-1細胞轉染miR-203a-3p mimic后，顯著抑制FOXP1的表達(P<0.01，圖3E)。

2.4下調FOXP1的表達對DLBCL細胞的增殖、侵襲和凋亡的影響 在SU-DHL-4和HBL-1細胞中轉染FOXP1小干擾RNA，FOXP1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(P<0.01，圖4A)。下調FOXP1后，細胞增殖能力明顯被抑制(P<0.01，圖4B和4C)，細胞侵襲能力也顯著下降(P<0.01，圖4D)，而細胞凋亡則明顯增加(P<0.01，圖4E和4F)。

nRH=20, nDLBCL=30. A：生物信息學網站預測miR-203a-3p與FOXP1的靶向位點及FOXP1的突變位點；B：熒光素酶報告基因實驗檢測熒光素酶的活性；C,D：qPCR檢測RH和DLBCL患者組織中FOXP1的mRNA表達及Western-blot檢測組織中FOXP1的蛋白表達量；E：轉染miR-203a-3p mimic后FOXP1的表達量. 與NC-mimic和FOXP1-WT組比較，△△：P<0.01；與NC-mimic組比較，##：P<0.01.圖3 FOXP1與miR-203a-3p的關系Fig 3 Relationship between FOXP1 and miR-203a-3p

A：qPCR檢測轉染效率，Western-blot檢測FOXP1蛋白表達量；B，C：CCK-8實驗檢測轉染后SU-DHL-4 和HBL-1細胞的增殖能力；D：Transwell實驗檢測轉染后細胞的侵襲能力；E：F圖對應的統計分析結果；F：流式細胞儀檢測轉染后細胞凋亡情況. 與Scramble組比較，△△：P<0.01.圖4 下調FOXP1的表達對DLBCL細胞的增殖、侵襲和凋亡的影響Fig 4 Effects of FOXP1 silence on proliferation, invasion and apoptosis of DLBCL cells

2.5過表達FOXP1和miR-203a-3p對DLBCL細胞的增殖和侵襲的影響 單獨過表達FOXP1時，FOXP1的mRNA和蛋白水平均高于Vector組(P<0.01)，而同時過表達miR-203a-3p和FOXP1時，可逆轉單獨過表達FOXP1對FOXP1水平的增加作用(P<0.01，圖5A和5B)。細胞增殖實驗和Transwell實驗顯示，當細胞轉染pcDNA-FOXP1或共轉染pcDNA-FOXP1和NC-mimic時，細胞的增殖和侵襲能力均增加，而共轉染pcDNA-FOXP1與miR-203a-3p mimic時，FOXP1對細胞增殖和侵襲的促進作用得到逆轉(P<0.01，圖5B～5F)。凋亡實驗結果顯示，與Vector組比較，過表達FOXP1可顯著抑制細胞凋亡(P<0.05，圖5G和5H)；而共轉染pcDNA-FOXP1與miR-203a-3p mimic時，逆轉過表達FOXP1對細胞凋亡的抑制作用。

2.6miR-203a-3p和FOXP1對Wnt/β-catenin信號通路的影響 免疫蛋白印跡實驗結果顯示，過表達miR-203a-3p或下調FOXP1時，Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的蛋白水平顯著降低(P<0.01)；共轉染miR-203a-3p mimic和si-FOXP1時，可進一步降低Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達(P<0.01)；而過表達FOXP1可顯著增加Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的蛋白表達水平(P<0.01)；當共轉染miR-203a-3p mimic和pcDNA-FOXP1時，Wnt1,β-catenin,Cyclin D1和c-Myc的表達水平得到逆轉(P<0.01，圖6)。

1：NC mimic+Scramble；2：NC mimic+Vector；3：miR-203a-3p mimic+Scramble；4：NC mimic+ si-FOXP1-1；5：NC mimic+pcDNA-FOXP1；6：miR-203a-3p mimic+si-FOXP1-1；7：miR-203a-3p mimic+pcDNA-FOXP1. A：Western-blot實驗檢測SU-DHL-4轉染后Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達水平；B：Western-blot實驗檢測HBL-1轉染后Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達水平；C，D分別是A，B對應的統計分析結果. 與NC-mimic+Scramble組比較，△：P<0.05；與NC-mimic+Vector組比較，#：P<0.05；與miR-203a-3p+Scramble組比較，☆：P<0.05.圖6 miR-203a-3p和FOXP1對Wnt/β-catenin信號通路的影響Fig 6 Effects of miR-203a-3p and FOXP1 on Wnt/β-catenin signaling pathway

3 討 論

研究報道，miRNA在人類癌癥發展的過程中扮演著重要的角色，其在腫瘤中的生物學作用和機制也逐漸明確[16]。miRNA通過與靶基因的3′-UTR結合來調控與癌癥發生發展相關的基因。miRNA的失調同樣參與DLBCL的發展過程，如耐潑尼松的DLBCL耐藥細胞中，miR-148b表達下調，可促進腫瘤細胞對潑尼松的抗性[17]；下調miR-195的表達，可促進DLBCL的發生和免疫逃逸[3]；高表達miR-27a通過抑制MET/PI3K/AKT通路促進DLBCL細胞凋亡，進而抑制DLBCL的發展[18]。

以往研究表明，miR-203a-3p在多種腫瘤組織中表達異常，包括肝癌、骨肉瘤及結直腸癌等，提示miR-203a-3p參與腫瘤的發展[19-21]。本研究以miR-203a-3p在DLBCL進展中的作用為出發點，結果發現，在DLBCL組織中，miR-203a-3p的表達量較RH組織顯著降低，提示miR-203a-3p在DLBCL中也存在異常表達的現象。當SU-DHL-4和HBL-1細胞過表達miR-203a-3p時，細胞增殖與侵襲受到抑制，且具有顯著性，表明miR-203a-3p在DLBCL中發揮抑癌作用。

FOXP1蛋白是多功能轉錄因子，從參與器官的發生到調節免疫功能代謝都發揮著重要的作用[22]。研究報道FOXP1在多種腫瘤中表達失調，既有抑癌作用，也有作為癌基因的作用，這取決于細胞環境，如Sheng等報道FOXP1在肺癌的發生發展中通過促進肺癌細胞的凋亡而起到保護作用[23]；相反，Wang等報道FOXP1能夠促進多發性骨髓瘤的進展[24]；另有文獻報道FOXP1可增強非小細胞肺癌的致瘤性[25]，促進肺癌細胞的增殖與侵襲[26]。本研究發現，DLBCL組織中FOXP1的表達水平顯著升高，當下調FOXP1時，可顯著抑制DLBCL細胞的增殖與侵襲，促進凋亡，說明FOXP1在DLBCL中扮演著癌基因的作用。

通過生物信息學網站預測到FOXP1是miR-203a-3p的一個靶基因，當細胞過表達miR-203a-3p時，FOXP1的表達受到抑制，說明miR-203a-3p可下調FOXP1的表達，而逆轉實驗同樣也說明miR-203a-3p可調節FOXP1的表達。文獻報道FOXP1可通過激活Wnt/β-catenin信號通路來促進腫瘤的發生發展[27]，因此本研究也進一步探討miR-203a-3p對FOXP1的調控是否與Wnt/β-catenin信號通路有關。當過表達miR-203a-3p或者下調FOXP1，Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達受到抑制，而當高表達FOXP1時，Wnt/β-catenin信號通路處于激活狀態，相關蛋白表達水平顯著升高，以上結果均說明miR-203a-3p調控FOXP1表達參與DLBCL的發展是通過Wnt/β-catenin信號通路實現的。

綜上所述，miR-203a-3p在體外能夠抑制DLBCL細胞的增殖、侵襲，促進凋亡，過表達miR-203a-3p能夠抑制FOXP1表達，導致Wnt/β-catenin信號通路的失活。這些結果均提示miR-203a-3p是DLBCL中一個重要的抑癌分子，可能成為DLBCL患者早期診斷或治療的潛在靶點。