3種不同染色方法對肺組織彈力纖維染色效果的影響

王鵬程， 陳林鶯， 翁丹楓， 張 聲， 李國平

彈力纖維是結(jié)締組織中重要的纖維之一，其主要的化學組成為彈性蛋白，彈性蛋白提供了彈力纖維的彈性。彈力纖維廣泛分布于身體的各器官及組織，主要存在于肺、心臟、血管、皮膚等部位中，富有彈性，極難溶解，新鮮時呈黃色，折光性強，常規(guī)H-E染色下呈現(xiàn)不同程度的紅色，不易與膠原纖維等組織區(qū)分，只有用特殊染色方法才能清楚顯示[1-2]。彈力纖維的染色方法較多，操作繁簡不一，染色結(jié)果參差不齊，筆者所在科室經(jīng)過多年實踐，積累了一些染色經(jīng)驗。現(xiàn)將Gomori醛復紅法進行改良，并與Verhoeff鐵蘇木精法和Weigert間苯二酚復紅法進行比較[3]，旨有探討改良Gomori醛復紅法在肺組織彈力纖維染色的應用意義。

1 材料與方法

1.1材料 收集送檢的住院手術患者的肺組織30例，均用體積分數(shù)為4%中性緩沖甲醛液固定(pH=7.2)，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片。

1.2主要試劑

1.2.1Verhoeff鐵蘇木精液 (1)蘇木精5 g充分溶于100 mL無水乙醇；(2)質(zhì)量分數(shù)為10%的氯化鐵：氯化鐵10 g充分溶于100 mL蒸餾水；(3)Lugol碘液；碘1 g和碘酸鉀2 g充分溶于100 mL蒸餾水。取上述3種溶液各20，8，8 mL混勻得到Verhoeff工作液。質(zhì)量分數(shù)為2%的三氯化鐵：三氯化鐵2 g充分溶于100 mL蒸餾水。

1.2.2Weigert間苯二酚復紅液 在100 mL蒸餾水中分別加入堿性品紅1 g、間苯二酚2 g，加熱煮沸，再緩慢加入12.5 mL 30%三氯化鐵，繼續(xù)加熱煮沸5 min，冷卻后過濾，將沉淀物溶于100 mL體積分數(shù)為95%的乙醇，最后加入2 mL濃鹽酸。

1.3方法

1.3.1Verhoeff鐵蘇木精法 石蠟切片脫蠟至水；Verhoeff工作液染30 min，蒸餾水快速沖洗；2%氯化鐵分化至彈力纖維呈黑色，背景呈灰色，蒸餾水快速沖洗；95%乙醇快速沖洗，用Van Gieson液復染30 s，濾紙吸干多余的染液；梯度乙醇快速脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.3.2Weigert間苯二酚復紅法 石蠟切片脫蠟至水；95%乙醇2 min；Weigert間苯二酚復紅液1～2 h；直接用95%乙醇洗去多余的染液至無余色脫下，蒸餾水沖洗；用Van Gieson液復染30 s，用濾紙吸干多余的染液；梯度乙醇快速脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.3.3改良Gomori醛復紅法 石蠟切片脫蠟至水；用酸性高錳酸鉀氧化5 min，蒸餾水稍洗；2%草酸漂白1 min，流水沖洗5 min；70%乙醇稍洗；用Gomori醛復紅液染色15～20 min，用70%乙醇浸洗2次，至切片不再脫色為止，蒸餾水稍洗；用1%亮綠復染1 min，蒸餾水稍洗；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.4結(jié)果判讀 組織學染色結(jié)果判斷標準采取單盲法，由3位高年資病理醫(yī)師審核具體評分(表1)。

表1 組織學評分標準

1.5統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5軟件分析數(shù)據(jù)。兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

Verhoeff鐵蘇木精法彈力纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細胞呈黃色；Weigert間苯二酚復紅法彈力纖維呈棕色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細胞呈黃色；改良Gomori醛復紅法彈力纖維呈深紫色，背景呈綠色。將3種彈力纖維染色結(jié)果兩兩比較，差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。改良Gomori醛復紅法較其他兩種方法操作簡單，定位準確，背景清晰，對比更明顯(圖1，2)。

本研究中3種方法的染色積分情況分別為(9.87±2.63)，(5.35±1.26)和(6.28±2.13)，進行兩兩比較，結(jié)果顯示改良Gomori醛復紅法的得分明顯高于其他兩組(P=0.009, 0.012)。

3 討 論

病理學檢測技術在病理診斷中具有舉足輕重的作用，已然成為診療疾病和判斷預后不可或缺的檢查手段之一。彈力纖維主要存在于皮膚、氣管、支氣管、肺泡、心血管、韌帶等處，彈力纖維染色可用于判斷組織中彈力纖維是否存在增生或者斷裂，具有重要的病理診斷以及鑒別診斷意義[4]。彈力纖維對肺組織中的細支氣管和肺泡壁具有支撐作用，為此，彈力纖維染色常用于一些呼吸系統(tǒng)疾病的鑒別診斷，比如支氣管擴張、肺氣腫、肺纖維化中彈力纖維蛋白的差異具有不同表現(xiàn)。此外，彈力纖維染色還有助于判斷是否侵犯臟層胸膜，用于區(qū)分原位癌與浸潤癌。由于常規(guī)的H-E染色中細胞間質(zhì)均呈不同程度的粉紅色至紅色，不易與其他纖維組織區(qū)分開來，往往需要采用特殊的染色方法才能更好地確定彈力纖維變化情況[5]。

彈力纖維的染色方法眾多，有醛復紅法、間苯二酚堿性品紅法、地衣紅法、稀釋間苯二酚堿性品紅法、維多利亞藍法、鐵碘蘇木精法等，部分方法染色需要較長時間，有的甚至需要過夜，操作繁瑣、費時，不宜在臨床工作中應用，常規(guī)的病理檢驗常采用醛復紅染色方法[6-8]。筆者所在科室經(jīng)過多年實踐積累，對肺組織彈力纖維染色有了一定的認識和體會，對Gomori醛復紅染色方法進行了改良，并與Verhoeff鐵蘇木精法和Weigert間苯二酚復紅法進行比較。改良Gomori醛復紅法中醛復紅對特殊的蛋白及含硫酸根的黏多糖有很強的親和力，與彈性蛋白結(jié)合牢固，同時改用酸性高錳酸鉀氧化后，其氧化能力明顯增強，比傳統(tǒng)醛復紅法中的Lugol碘液更強，可明顯提高耐酸纖維及前彈力纖維的染色效果[9-11]。高錳酸鉀見光易分解變質(zhì)，宜用棕色試劑瓶保存。醛復紅液的配制相對簡單，1～2 d即可成熟，成熟后過濾至試劑瓶中放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂脮r恢復至室溫染15～20 min(冬季可適當延長染色時間)。Verhoeff鐵蘇木精法是彈力纖維經(jīng)典的染色方法之一，雖該法操作簡單、染色時間相對較短、不易褪色、粗纖維著色較深，但是較細的兩種纖維染色相對差，鐵碘蘇木精配制較繁瑣，染色沒有選擇性，細胞核和膠原纖維也可以有不同程度的著色，且分化程度不易掌握和判斷，需在顯微鏡下進行控制[12-13]。Weigert間苯二酚復紅法對于較細的彈力纖維染色不明顯，對比不清晰，而且Weigert間苯二酚復紅法中間苯二酚堿性品紅液配制相對復雜，需要加熱，所需試劑種類較多，相較其他兩種方法染色時間更長，需1～2 h，初學者不易掌握。改良Gomori醛復紅染色液是堿性品紅加入三聚乙醛和鹽酸配制而成的，鹽酸是酸性催化劑，可使三聚乙醛解聚產(chǎn)生乙醛，具有更高活性的乙醛與堿性品紅染料的氨基發(fā)生反應，從而產(chǎn)生偶氮甲堿，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙f明染液已成熟。成熟的染液對特定的蛋白及含硫酸根的黏多糖具有很強的親和力，可與彈力纖維緊密結(jié)合。3種方法雖然均能染出肺組織彈力纖維，但從染色方法及效果可以看出，改良Gomori醛復紅染色法能夠較好地染出肺組織彈力纖維的形態(tài)變化，而且操作簡單，背景干凈，對比明顯，易于觀察，是目前肺組織彈力纖維最佳的染色方法。在實驗過程中，改良Gomori醛復紅法應注意醛復紅液為70%乙醇配制，在實際的染色操作中需注意防止干片，最好采用油性筆畫線、放入濕的孵育盒或者浸染，70%乙醇分化至肉眼下無色為止，不可過度分化，防止彈力纖維褪色，必要時在顯微鏡下控制分化效果。由于Weigert間苯二酚復紅法用Van Gieson液復染時間比較短，不易掌握，很容易過染而覆蓋彈力纖維的顏色，黃色和棕色對比不明顯，且Van Gieson液復染后易褪色，不利于切片的保存，給回顧性研究造成困難。改良Gomori醛復紅法改用亮綠復染，時間稍長，比較容易控制，綠色和紫色對比更明顯，且亮綠不易褪色，保存時間久，但亮綠也要淡染，不可因染色過度而覆蓋彈力纖維染色，從而影響觀察及對比[14-16]。操作過程中也不能忽視常規(guī)H-E染色或者其他檢查的重要性，只有在觀察H-E染色后懷疑彈力纖維病變或者某些診斷需要輔助診斷時才做該染色加以證明。

筆者認為，改良后的Gomori醛復紅方法操作簡單，背景清晰，對比明顯，結(jié)果可靠，是目前肺組織彈力纖維染色最佳的染色方法，值得在臨床病理工作中推廣應用。