兩種中藥酊劑微生物限度方法適用性研究

楊群，肖文濤

九江市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 九江 332000

酊劑系指將原料藥物用規(guī)定濃度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液體制劑，微生物污染情況是重要的藥品質(zhì)控指標(biāo)［1,2］。按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）四部規(guī)定，非無(wú)菌產(chǎn)品需做微生物限度檢査，且需采用通過(guò)方法適用性試驗(yàn)的檢查方法。本研究中兩種酊劑復(fù)方補(bǔ)芷酊、養(yǎng)血首烏酊由不同中藥原料經(jīng)乙醇提取制成，由于提取溶劑為75%的乙醇，以及中藥原料固有成分的復(fù)雜性，存在不同程度的抑菌作用。依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107 要求，制劑進(jìn)行微生物限度檢查前應(yīng)先消除其抑菌活性，避免試驗(yàn)干擾。本文對(duì)兩種酊劑需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)適用性試驗(yàn)研究，消除制劑的抑菌性，建立準(zhǔn)確可靠的微生物限度檢查方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LMQ.C型高壓蒸汽滅菌器（山東新華儀器有限公司）；YP1002N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；BSC-1304IIB2型生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）；LRH-150型細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SPX-150型霉菌培養(yǎng)箱（揚(yáng)州慧科科學(xué)儀器有限公司）；GHP-9162型生化培養(yǎng)箱（揚(yáng)州慧科科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑、試藥及培養(yǎng)基

復(fù)方補(bǔ)芷酊（批號(hào)：20200110、20200122、20200205）、養(yǎng)血首烏酊（批號(hào)：20200106、20200117、20200203），均由景德鎮(zhèn)市皮膚病醫(yī)院提供。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：190329），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190518），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190402），pH 7.0 氯化鈉緩沖蛋白胨水（批號(hào)：200319），均為北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；溴化十六烷基三甲胺瓊脂（批號(hào)：1073801），甘露醇氯化鈉瓊脂（批號(hào)：3102307）均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 工作菌株

枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501（批 號(hào)：200411），金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003（批號(hào)：200305），銅綠假單胞菌CMCC（B）10104（批號(hào)：200317），白色念珠菌CMCC（F）98001（批號(hào)：201108），黑 曲 霉CMCC（F）98003 （批號(hào)：200514），均由北京三藥技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

復(fù)方補(bǔ)芷酊和養(yǎng)血首烏酊均為皮膚給藥制劑，其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)如下：需氧菌總數(shù)不超過(guò)100 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為200 cfu），霉菌和酵母菌總數(shù)不超過(guò)10 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為20 cfu），不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1 mL）。

2.1 菌液制備

取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉凍干物，分別吸取復(fù)溶液1 mL加入菌株西林瓶中，蓋上瓶蓋，靜置5～10 s，渦旋震蕩5～10 s。吸取1 mL加入9 mL無(wú)菌生理鹽水，混勻，逐級(jí)進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)罱K使其含菌數(shù)約5 000～10 000 cfu/mL。

2.2 供試液制備

取供試品10 mL，置錐形瓶中，加無(wú)菌生理鹽水至100 mL，震蕩混勻，作為1∶10供試液。

2.3 回收測(cè)定（平皿法）

2.3.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組：取供試液9.9 mL，加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試品中含菌量不大于100 cfu。取1 mL注入平皿，立即注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結(jié)果。

供試品對(duì)照組：取上述供試液，以稀釋液代替菌液，同實(shí)驗(yàn)組操作，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

菌液對(duì)照組：取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組：取上述試液9.9 mL，加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試品中含菌量不大于100 cfu。取1 mL注入平皿，立即注入沙氏瓊脂培養(yǎng)基，置25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～120 h逐日觀察結(jié)果。供試品對(duì)照組：取上述供試液，以稀釋液代替菌液，同實(shí)驗(yàn)組操作，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。菌液對(duì)照組：取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

2.4 回收計(jì)算

按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收比例：

表1 試驗(yàn)組加菌的回收率 %

由表1可見(jiàn)，平皿法對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌有極強(qiáng)的抑制作用，選用薄膜過(guò)濾法對(duì)需氧菌進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5 回收測(cè)定（薄膜過(guò)濾法）

2.5.1 實(shí)驗(yàn)組取供試液1 mL，采用薄膜過(guò)濾法，每筒用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗(yàn)菌，濾干，立即貼膜與胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結(jié)果。

2.5.2 供試品對(duì)照組取上述供試液，以稀釋液代替菌液，同實(shí)驗(yàn)組操作，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.5.3 菌液對(duì)照組取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

表2 試驗(yàn)組加菌的回收率 %

由表2可見(jiàn)，薄膜過(guò)濾法可消除制劑的抑菌作用，選用薄膜過(guò)濾法對(duì)需氧菌進(jìn)行試驗(yàn)。

2.6 樣品細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查結(jié)果

取復(fù)方補(bǔ)芷酊和養(yǎng)血首烏酊各3批，需氧菌總數(shù)按照薄膜過(guò)濾法操作步驟，霉菌和酵母菌總數(shù)按照平皿法操作步驟，對(duì)6批樣品進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果顯示，樣品中需氧菌總數(shù)均小于10 cfu/mL、霉菌和酵母菌總數(shù)均小于10 cfu/mL，符合相關(guān)規(guī)定。

2.7 控制菌檢查結(jié)果

取復(fù)方補(bǔ)芷酊和養(yǎng)血首烏酊各3批，金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌按照薄膜過(guò)濾法操作步驟，結(jié)果顯示，樣品中金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌均未檢出。

3 討論

兩種制劑采用平皿法檢驗(yàn)時(shí)，對(duì)需氧菌有明顯抑菌作用，金色葡萄球菌和銅綠假單孢菌回收率遠(yuǎn)低于70%，對(duì)霉菌則無(wú)影響。該兩種醫(yī)院制劑由75%乙醇提取制成，經(jīng)測(cè)定制劑乙醇實(shí)際濃度60%～70%，乙醇溶劑20%即具有不同程度的抑菌作用。同時(shí)中藥成分復(fù)雜，自身也存在不同程度的抑菌作用，其抗菌作用不僅體現(xiàn)在方劑有效成分對(duì)細(xì)菌直接抑殺，同時(shí)還表現(xiàn)在方劑中各味藥多種成分相互作用的綜合效應(yīng)上［3］。考慮兩種制劑均有一定的抑菌性，且易溶于水，采用薄膜過(guò)濾法可快速、有效地去除藥品中所含有的抑菌性，提高檢驗(yàn)的效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性［4］，而平皿法相對(duì)簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，微生物檢驗(yàn)時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況采用不同稀釋級(jí)的平皿法或薄膜過(guò)濾法檢測(cè)［5］。

本研究根據(jù)其對(duì)不同菌種的抑菌特性，可采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定需氧菌，平皿法測(cè)定霉菌及酵母菌，結(jié)果可靠，回收率均達(dá)到0.5～2.0。建立了可靠的微生物檢查方法，消除干擾，為含抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)的研究提供參考和研究思路，進(jìn)一步保證制劑的檢測(cè)可靠性和科學(xué)性。