不同孕期胎盤生長因子和血管內皮生長因子水平與胎兒生長受限發生風險的關聯分析

劉兆敏， 蒲元林， 吳慧捷， 李 麗

胎兒生長受限(fetal growth restriction, FGR)是造成胎兒死亡的主要原因之一，在所有新生兒中的發生率為5%～10%[1-2]。FGR影響胎兒日后的正常生長發育，如造成神經發育缺陷，增加成年后代謝性疾病和行為失調疾病的發生風險等[3-6]。胎盤生長因子(placental growth factor，PlGF)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的促血管生成因子，在胎兒的生長發育中發揮重要作用[7-9]。文獻報道，PlGF和VEGF或許與FGR的發生和發展相關[10]，孕晚期的血漿PlGF表達水平可能可作為FGR發生風險的預測標志物，注射VEGF可預防小鼠FGR的發生[11-12]。本研究擬探討不同孕期孕婦血清PlGF和VEGF的表達水平及其與FGR發生風險的關聯分析。

1 對象與方法

1.1對象 選取2016年7月—2018年6月在筆者醫院進行產前檢查的326例孕婦作為研究對象。入組標準：(1)確診妊娠時間≤8周。(2)年齡20～35歲。(3)同意參與本研究并能進行定期復查。排除標準：(1)患有妊娠期并發癥，如妊娠期合并慢性高血壓病、糖尿病或腎病。(2)既往生殖系統手術史、腫瘤或嚴重感染史。(3)多胎妊娠。本研究經筆者醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2樣本采集及檢測 所有受試者入組后分別于孕早期(妊娠≤13周)的10～13周、孕中期(妊娠14～27周)的19～22周和孕晚期(妊娠≥28周)的33～35周，在孕婦靜息狀態下采集空腹時的外周血于真空采血管中。待其凝固后，在4 ℃、2 000 r/min的條件下離心15 min，分離血清，置于-80 ℃保存以待檢測。采用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中PlGF和VEGF的表達水平，每份樣本3孔，單次重復。PlGF采用人PlGF試劑盒(美國Abcam公司)進行檢測，敏感度2 pg/mL，最低檢出濃度 1.372 pg/mL，批次間差別<12%，批次內差別<10%，檢測波長450 nm，檢測同批進行。另外，VEGF采用人VEGF ELISA試劑盒(美國Abcam公司)進行檢測，敏感度低于5 pg/mL，最低檢出濃度23.4 pg/mL，批次間差別8.1%，批次內差別4.7%，檢測波長450 nm，檢測同批進行。同時，為了減少樣本放置時間過長可能帶來的樣本異常從而影響結果的準確性，所有樣本為分批次檢測，每半年1次。

1.3分組 FGR的診斷采用《婦產科學》第8版教材中的診斷標準[13]。根據FGR的診斷結果將受試者分為FGR組和正常妊娠組。

2 結 果

2.1一般臨床資料 入組孕婦的年齡為(29.8±4.4)歲(18～45歲)，妊娠次數為(2.5±0.9)次(1～5次)，生產次數為(1.4±0.5)次(1～3次)，流產次數(1.1±0.7)次(0～3次)。本研究中肥胖(BMI ≥30 kg/m2)、吸煙以及酗酒的孕婦例數分別為45例(13.8%)，42例(12.9%)和13例(4.0%)。總體新生兒的出生體質量為(2 872.3 ± 247.5)g(2 120～3 623 g)，Apgar評分為(9.2±0.6)(7～10)。

2.2孕早期、孕中期和孕晚期孕婦血清PlGF和VEGF的表達水平 326例孕婦中，孕中期和孕晚期的血清PlGF表達水平(均P<0.001)和VEGF(均P<0.001)顯著低于孕早期(表1)。

表1 不同孕期PlGF和VEGF表達水平

2.3孕婦血清PlGF和VEGF表達水平在不同孕期中的相關性分析 326例孕婦中，孕婦的孕早期(r=0.227，P<0.001)、孕中期(r=0.288，P<0.001)和孕晚期(r=0.375，P<0.001)血清PlGF與VEGF表達水平均呈正相關。

2.4血清PlGF和VEGF表達水平差別 FGR組的孕早期血清PlGF表達水平和正常妊娠組中比較，差別無統計學意義(P=0.153)；FGR組的孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)PlGF表達水平均顯著低于正常妊娠組。FGR組孕早期的VEGF表達水平與正常妊娠組比較，差別無統計學意義(P=0.089)，而FGR組孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的VEGF表達水平均顯著低于正常妊娠組。另外，采用中位倍數法分析結果顯示，FGR組孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的PlGF水平均顯著低于正常妊娠組；同時，FGR組孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的VEGF水平顯著低于正常妊娠組(表2)。

2.5不同孕期PlGF和VEGF表達水平與FGR發生風險的關聯分析 ROC曲線分析顯示，孕婦PlGF孕早期表達水平不能預測FGR的發生風險，但孕中期和孕晚期孕婦的PlGF表達水平均對FGR的發生風險具有較好的預測作用，其中孕晚期PlGF的表達水平對FGR發生風險的預測作用最好，AUC分別為0.577(95% CI：0.466～0.688)，0.762(95% CI：0.674～0.850)和0.900(95% CI：0.845～0.955)(圖1A)。孕早期的VEGF表達水平對FGR的發生風險無預測作用，但孕中期和孕晚期VEGF表達水平對FGR的發生風險具有較好的預測作用，其中孕晚期的預測作用最好，AUC分別為0.592(95% CI：0.478～0.705)，0.729(95% CI：0.639～0.819)和0.861(95% CI：0.801～0.920)(圖1B)。

3 討 論

本研究通過檢測孕婦血清PlGF和VEGF在不同孕期的表達水平及其表達水平的關聯，分析PlGF和VEGF與FGR發生風險的關聯，發現：(1)孕中期和孕晚期孕婦的血清PlGF和VEGF表達水平均較孕早期低，且PlGF和VEGF表達水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正相關。(2)與正常妊娠者比較，FGR患者孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF顯著降低；ROC曲線表明，孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF均可以預測FGR的發生風險，其中孕晚期兩者的表達水平對FGR的預測作用最好。

表2 FGR組和正常妊娠組不同孕期PlGF和VEGF表達水平的差別分析

PlGF是VEGF家族的一員，由胎盤滋養層產生，它除了促血管生成作用外，還可以促進有絲分裂，是保證胎盤正常發育的重要物質[14-15]。由于PlGF在胎盤發育和血管生理中的重要作用，參與多種疾病的病理過程[16]。有研究表明，抑制PlGF的表達水平在多種動物模型中(包括視網膜病、脈絡膜新生血管性疾病和糖尿病動物模型)可減少新血管形成和毛細血管異常[17]。VEGF是重要的促血管生成因子，其在內皮細胞中具有促進有絲分裂和抗凋亡的作用。同時，VEGF還具有增加血管滲透性和促進細胞遷徙的作用[18]。因此，VEGF在多種疾病中發揮著重要作用，如在多個腫瘤中作為治療靶點，輔助一些眼科疾病的治療等[19]。

在正常的妊娠過程中，PlGF的表達水平隨著孕周的增長而增加，到達峰值后逐漸下降。與PlGF類似，正常妊娠中VEGF的水平也隨著孕周的增加而上升，達到峰值后下降。以往的一些研究顯示，PlGF與胎兒異常的生長和發育相關。一項巢式隊列研究的結果表明，孕婦32～35孕周時較低的血漿PlGF水平與胎兒低出生體質量顯著相關[20]。另外一項回顧性隊列研究的結果顯示，孕婦血漿PlGF較低可預測孕婦高血壓病、不良的圍產期結果以及胎兒過低體質量[21]。此外，一項大樣本前瞻性隊列研究顯示，較低的臍帶血PlGF水平(采用中值倍數法表示)與較低的出生體質量、不正常的胎兒生長模式及更高的FGR發病風險相關[22]。另外一項回顧性隊列研究的結果表明，與分娩適于胎齡兒和大于胎齡兒的產婦比較，發生FGR產婦的母血和臍血中的PlGF水平顯著降低，且母血PlGF水平與新生兒出生體質量、頭圍、腹圍以及BMI均呈正相關[23]。VEGF與胎兒的宮內生長發育相關。一項在靈長類動物(狒狒)中進行的實驗表明，胎盤基板的VEGF基因輸送可以促進子宮動脈重塑，從而促進胎兒生長[24]。VEGF/VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)系統在早期胎兒發育中，或許調控參與犁鼻器化學受體前體以及神經前體遷移[25]。采用VEGF抑制劑KRN633干預孕中期的小鼠可以誘發胎兒小鼠的視網膜血管生長發育異常[26]。孕婦血清VEGF水平的下降和可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平的上升與更高的胎兒的生長和發育受限風險相關[27]。臍帶血血漿VEGF水平與胎兒出生體質量正相關，而sFlt-1水平與胎兒出生質量負相關；另外，較高的臍帶血VEGF水平與較低的胎兒產后發育遲緩發生風險相關，而sFlt-1呈現相反的趨勢[28]。正常足月妊娠的產婦胎盤滋養細胞和血清中的VEGF表達水平顯著高于FGR的產婦[29]。

本研究檢測不同孕期PlGF在孕婦血清中的表達水平，并評估了其與FGR發生風險的關聯，結果顯示，孕婦孕中期和孕晚期的血清PlGF表達水平均低于孕早期。同時，FGR患者PlGF孕中期和孕晚期的表達水平與正常妊娠者比較顯著下降，且對FGR的發病風險具有較好的預測作用，其中孕晚期PlGF表達水平對FGR發生風險的預測作用最好。PlGF可以預測FGR發生風險的原因可能為：PlGF在胎兒的生長發育中能促進有絲分裂和血管形成，在胎兒的生長發育中起至關重要的作用，較低的PlGF水平可能導致胎兒不能及時完成正常生長發育，故本研究中孕婦血清PlGF隨著孕期的進展而下降。

另外，本研究檢測了不同孕期VEGF在孕婦血清中的表達水平及其與FGR發生風險的關聯，發現孕婦孕中期和孕晚期的血清VEGF水平顯著低于孕早期，VEGF孕中期和孕晚期的表達水平在FGR患者中顯著低于正常妊娠者，且對FGR發生風險具有較好的預測作用，其中VEGF孕晚期水平對FGR發生風險的預測作用最好。關于VEGF對FGR的預測作用，考慮與以下原因有關：VEGF可以通過調節犁鼻器化學受體前體以及神經前體遷移，促進血管生成從而促進胎兒的正常生長發育，因此，FGR患者的血清孕中期和孕晚期VEGF水平顯著低于正常妊娠的孕婦，且孕晚期的VEGF水平對FGR的發生具有較好的預測作用[24-26]。另外，本研究還發現，孕婦血清PlGF和VEGF水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正比。有研究報道，PlGF可通過促進VEGF與Flt-1受體分離，并促進VEGF與更強的受體VEGF受體-2(KDR)結合，從而增強VEGF的信號傳導，這或許可以解釋為什么本研究中兩者的血清水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正相關[15]。另外，關于孕期其他因素可能對FGR產生的影響，如妊娠期并發癥、妊娠期營養素缺乏等，應在后續研究加入分析。

本研究同時檢測了兩個血管生成因子PlGF和VEGF與FGR發生風險的關聯，且樣本量較大，但同時也存在一些缺陷：(1)本研究納入的受試者多數來自中國同一地區，可能造成結果的代表性不足。(2)本研究為一項觀察性研究，可能會產生一些混雜因素，如孕婦的流產史或年齡過大等因素可能會對結果造成影響。(3)本研究采集孕婦的血液樣本進行PlGF和VEGF的檢測，而血液樣本中標志物的表達水平較容易受到其他因素的影響，可能因此導致本研究在評估孕早期、孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF表達水平之間的關聯時，關聯系數普遍較小。(4)本研究未將孕晚期做更詳細的劃分，可能造成孕晚期的結果對于臨床的指導意義較低。(5)另外，本研究未從不同維度評估PlGF/VEGF對FGR發生風險的預測作用，如孕早期、孕中期和孕晚期PlGF或VEGF表達水平的變化趨勢或表達量差別對于FGR的預測作用。