點按手法對CCI模型大鼠背根神經節PKC及P2X3表達的影響

陳樂春， 林志剛， 陳少清， 張幻真， 秦 麗， 陳水金， 王詩忠

神經病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是一個復雜的病理生理過程，坐骨神經痛、腰椎間盤突出癥等多種常見疾病均屬于NP[1]。NP常反復發作，持續過程長，需長期治療[2]。目前，針對NP的總體療效欠佳，約50%的患者疼痛不能得到充分緩解。持續的疼痛感受導致患者的情緒、睡眠、工作和生活質量受到影響，也給社會醫療資源和患者的經濟帶來沉重負擔[1,3]。中醫推拿屬于祖國傳統醫學，臨床應用鎮痛效果顯著，在治療神經根型頸椎病、腰椎間盤突出癥、坐骨神經痛等疾病均有良好的臨床療效[4-6]，且副作用小[7]，具有獨特優勢。本研究擬通過疼痛行為學、蛋白免疫印跡、蘇木精-伊紅染色(H-E染色)等方法觀察推拿常用的鎮痛手法——點按對慢性壓迫性神經損傷模型(chronic constriction injury, CCI)大鼠的鎮痛作用，觀察點按法干預對CCI模型大鼠DRG神經元PKC及P2X3表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物及分組 SPF級180～220 g雄性SD大鼠[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號為SCXK(滬)2017-0005] 80只，統一飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心的SPF級實驗室，模擬標準日夜系統，予以自由飲食及飲水。隨機分為4組(每組20只)：空白組、模型組、假手術組、造模+點按組。

1.2主要藥品及試劑β-actin抗體、P2X3抗體、兔抗PKC多克隆抗體、戊巴比妥鈉(批號：B20150801，大連美侖生物技術有限公司)。

1.3主要儀器 恒溫水浴鍋、顯微鏡、蛋白核酸分析儀、無線觸覺力按摩指套(日本Finger TPS公司)、自制推拿固定器。

1.2方法

1.2.1動物模型制備

1.2.1.1建模 采用Bennett和Xie模型制備方法建立大鼠CCI模型[8]，假手術組大鼠僅暴露坐骨神經后縫合，不打結，其余按模型制備手術操作。

1.2.1.2模型評估 CCI模型制備后大鼠出現跛行，足呈輕度外翻狀，且有時出現舔舐、懸空等后肢保護現象，表明坐骨神經慢性擠壓傷模型(CCI模型)制備成功。造模后常規肌內注射青霉素預防感染，若出現感染及其他疾患者棄去不用，對應補充，直到滿足實驗要求。

1.2.2觸誘發痛的測定(von Frey 測試) 正式測試前大鼠靜置籠中15 min適應環境。采用1～26 g不同等級的von Frey纖維絲由低等級向高等級逐一刺激大鼠雙側后肢足底心，加壓至纖維絲彎曲持續5 s。每個纖維絲等級測試5次，其中有3次刺激出現大鼠縮足(記3個“+”號)則停止向上一等級測試，改向下一級重復測試，確定下一級不出現3個“+”號。機械痛足反射閾值為首個出現3個“+”的纖維絲等級。同一只大鼠兩次測試需間隔至少30 s。

1.2.3干預措施 空白組不做任何處理，正常喂養；模型組、假手術組按上述手術操作；造模+點按組在造模后第4天介入點按手法，各組在相同環境及條件下正常喂養。

點按手法操作及取穴：先將大鼠固定，適應環境15 min。用手握空拳，拇指伸直并緊貼于食指中節的橈側面，以拇指端為力點緊貼于大鼠術側“委中穴”(后肢腘橫紋中央)，用力要由輕到重(最大8 N)，穩而持續，至最大力時維持并停留3 s，后緩慢瀉力，為1遍，重復10遍為1組。忌用暴力。為規范手法刺激量，采用拇指帶上無線觸覺力按摩指套進行手法操作，可實時顯示作用力大小，控制力度最大為8 N，每天1組，連續干預18 d。

1.2.4蛋白免疫印跡(Western-blot)方法 干預完成后第2天，每組取10只大鼠斷頭處死，立即置于冰上，快速取出L4～L5背根神經節(dorsal root ganglion,DRG)，置于離心管中，稱體質量。經組織裂解，超聲粉碎、勻漿、離心、取上清，依BCA蛋白定量法檢測各組蛋白濃度。

蛋白電泳：按順序安裝好轉膜裝置，排出氣泡，轉膜，染色，漂洗，標記Marker位置，除染色，抗原抗體反應及顯色(兔抗P2X3一抗，山羊抗兔二抗)，洗膜，膜片條帶掃描及分析，圖像采用Smart view分析軟件得出條帶密度值。

2 結 果

2.1大鼠觸誘發痛指標結果 造模后，與空白組和假手術組比較，模型組和造模+點按組大鼠的觸誘發痛在術后即開始下降(P<0.01)，表明存在痛覺過敏現象。點按手法干預后，與模型組比較，造模+點按組大鼠的觸誘發痛在術后1～7 d無明顯差別，至術后14 d開始上升，差別有統計學意義(P<0.05)，至21 d差別更為明顯(P<0.01，表1，圖1)。

表1 各組大鼠不同時間點觸誘發痛von Frey測試結果

2.2大鼠DRG中PKC及P2X3的表達情況 與空白組和假手術組比較，模型組大鼠DRG中PKC及P2X3的表達水平差別有統計學意義(P<0.01)；推拿手法干預后，造模+點按組大鼠DRG中的PKC表達水平低于模型組[差別具有統計學意義(P<0.05)],高于空白組和假手術組[差別具有統計學意義(P<0.05)];P2X3受體的表達水平低于模型組(P<0.01)，高于空白組和假手術組，差別具有統計學意義(P<0.05，圖2)。

3 討 論

NP表現為慢性的自發性疼痛、痛覺過敏、異常疼痛和感覺異常等臨床特征[3,9]，從外周痛覺感受器到DRG再到脊髓上行至更高級的疼痛中樞，這個通路上任何一個環節出現問題都會導致疼痛信號傳導異常。信號異常放大則引起疼痛過敏，相反則出現疼痛減退。

DRG細胞作為疼痛信號傳遞的中轉站，在疼痛信息傳遞和整合過程中發揮著重要作用[10-11]。DRG細胞的離子通道功能改變，可導致初級傷害感受性神經元的敏感性和興奮性增加，引起中樞敏化[12]。P2X3受體是一個對PKC調整敏感的表型開關，在DRG細胞中PKC信號傳遞途徑可導致神經元表面的P2X3受體激活，受體的活性和表達上調可引發一系列反應，是外周和中樞痛敏形成的病理基礎[10-12]。

本研究發現，造模組大鼠DRG中的PKC和P2X3的表達水平較空白組和假手術組增高，差別具有統計學意義(P<0.01)，提示坐骨神經CCI模型大鼠DRG細胞中存在PKC和P2X3過表達，證實PKC及P2X3與NP相關。通過推拿手法干預后，PKC表達水平(P<0.05)及P2X3受體的表達水平(P<0.01)均下降。筆者推測，推拿手法可能抑制DRG細胞中PKC表達及介導P2X3受體表達，抑制離子通道功能，降低DRG對于疼痛的敏感性和興奮性，從而降低傳遞效能，使疼痛信號上行傳遞抑制或中斷，發揮鎮痛作用。

中醫推拿在治療慢性疼痛方面具有獨特優勢，而推拿手法在神經信號通路方面如何發揮作用值得研究。本研究通過點按法干預CCI模型大鼠，證實DRG神經元PKC-P2X3通路與NP相關。與假手術組及空白組比較，CCI模型大鼠的DRG細胞存在PKC和P2X3過表達，推拿手法干預可抑制CCI模型大鼠DRG中PKC及P2X3的表達，發揮鎮痛作用。