地膚子粗提物對變異鏈球菌作用的體外實驗研究

張夢馳， 常 琳， 涂方祥， 盧友光

齲病是一種細菌感染性疾病，變異鏈球菌是主要的致齲菌。細菌以食物為底物，分解糖產酸，使黏附于牙面的牙菌斑內pH降低，造成局部脫礦，產生齲損。因此，通過抑制變異鏈球菌的生長、黏附、產酸可以起到防齲作用。天然藥物有毒副作用小、不會引起菌群失調的優點，對齲病的預防作用日益受到重視，越來越多針對天然藥物防治齲病的相關研究相繼出現，如針對非洲的斑鳩菊、榆綠木、藤黃，拉美國家的可可果、血根草，以及中國和日本的中草藥、茶的研究[1]。在國內，已有研究發現，厚樸、茶多酚、五倍子等天然藥物對致齲菌均有一定的抑制作用[2-4]。地膚子俗稱掃帚草，是一種傳統的中草藥，有抗菌、抗炎、抗敏等功效。地膚子復方制劑對尿路感染、急性乳腺炎及多種皮膚病均有較好的療效。有研究顯示，地膚子有良好的抗病原微生物的作用[5]。因此，本實驗主要研究地膚子粗提物對致齲菌(變異鏈球菌)生長、黏附、產酸的抑制作用，為天然藥物地膚子用于齲病的預防提供依據。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 變異鏈球菌國際標準株ATCC25175(四川大學華西口腔醫學院惠贈)；地膚子(產地河北，購自福州市回春堂大藥房，由福建中醫藥大學車蘇容副教授鑒定)；BHI固體及液體培養基，無水乙醇(分析純)，磷酸鹽緩沖液，卡那霉素(EZ2811F23，上海易匯生物科技有限公司)；旋轉蒸發器(RE2000，上海亞榮生化儀器廠)；pH檢測儀(Sartorius AG，北京賽多利斯公司)。

1.2方法

1.2.1地膚子粗提物的制備 將地膚子研磨成粉，稱取100 g置于燒杯中，加入2 L體積分數為80%的乙醇，25 ℃浸提48 h[6]。過濾，棄濾渣得到浸提液，55～60 ℃水浴中負壓冷凝旋轉蒸發至浸膏狀，密封放置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2實驗菌株及菌懸液的制備 變異鏈球菌國際標準株ATCC25175復蘇48 h后，接種于BHI液體培養基中，置于厭氧箱(80% N2，10% CO2，10% H2，37 ℃)中培養18 h。涂片檢查及生化鑒定為純培養后，細菌在BHI固體培養基上傳代，接種環取固體培養基上的單菌落，用無菌生理鹽水將細菌配制成0.5號麥氏管濁度的菌懸液備用[7]。

1.2.3地膚子粗提物對變異鏈球菌體外生長的影響 稱取地膚子粗提物1.0 g，加入10 mL BHI液體培養基，配制成濃度為100 mg/mL的母液，置于高壓滅菌器中(0.1 MPa，121.5 ℃)，高壓15 min，置于無菌操作臺中備用。設置8個實驗組和1個陽性對照組。倍比稀釋法將母液稀釋成8個濃度梯度(0.78，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50及100 mg/mL)，設置卡那霉素濃度50 mg/mL為陽性對照組。BHI固體培養基倒板(每平板約5 mL)，凝固備用。BHI固體培養基(低熔點)冷卻至室溫，加入菌液混合均勻，倒入已凝固的培養基表層(每平板約5 mL)，放入4 ℃冰箱凝固。用已滅菌的小鋼管在凝固平板上層打孔，小心挑去小塊培養基做成圓孔，每板3孔，共9孔。圓孔中分別注入80 μL實驗組及對照組藥物，置入4 ℃冰箱中，預擴散2 h，37 ℃厭氧箱中培養24 h，測定抑菌圈大小[8]。實驗重復3次。

黏附抑制率=[(對照組OD630 nm-實驗組OD630 nm)/對照組OD630 nm]×100%

1.2.5地膚子粗提物對變異鏈球菌產酸作用的影響 同1.2.4的方法配制4個實驗管和1個對照管溶液，混勻。用酸度計將已配制好的實驗管與對照管溶液初始pH值調為7.4，厭氧培養箱中培養18 h。18 h后各試管以3 000 r/min離心15 min，取上清液，測定pH值[10]，每管測定3次，結果取平均值，計算pH的變化值(ΔpH)，實驗重復3次。

ΔpH=初始pH值(7.4)-終末pH值

1.3統計學處理 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析比較各組總體均數，采用Dunnett-t檢驗比較多個實驗組與對照組均數的差別。P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1地膚子粗提物對變異鏈球菌體外生長的影響 3次實驗中，實驗組均未出現抑菌圈，陽性對照組均出現明顯抑菌圈，抑菌圈直徑平均值1.5 cm。實驗表明，在100 mg/mL時地膚子粗提物對變異鏈球菌體外生長無明顯抑制作用(圖1)。

2.2地膚子粗提物對變異鏈球菌黏附作用的影響 隨著地膚子粗提物濃度的升高，黏附于試管壁的細菌越少，黏附抑制率也隨之增高(圖2)。分析結果表明，各濃度組黏附細菌的OD值總體均數不全相等，經Dunnett-t檢驗，地膚子粗提物4個濃度實驗管與對照管比較具有明顯抑制變異鏈球菌黏附的作用。各實驗管對變異鏈球菌黏附的抑制能力與對照管比較，差別均具有統計學意義(P<0.001，圖2～3)。

2.3地膚子粗提物對變異鏈球菌產酸作用的影響

隨著地膚子粗提物濃度的升高，ΔpH越來越小，各濃度管抗酸的pH值總體均數不全相等，經Dunnett-t檢驗，地膚子粗提物4個濃度實驗管與對照管比較具有抑制變異鏈球菌產酸的作用。各實驗管相比于對照管，對變異鏈球菌產酸的抑制能力均有差異性，且差別均具有統計學意義(P<0.001，圖4)。

3 討 論

齲病的發生、發展與致齲菌的生長、黏附、產酸、產胞外多糖等息息相關，而變異鏈球菌是公認的致齲菌[11]。控制齲病的關鍵在于預防，目前防齲藥物主要包括氟化物、抗生素、免疫制劑等。氟化物應用過量會導致氟牙癥及氟骨癥。長期使用抗生素防齲會導致耐藥及菌群失調。免疫防齲效果目前尚不清楚[12]。而天然藥物具有毒副作用小、不會引起菌群失調的優點，在齲病的預防中日益受到重視，相關研究通過探討天然藥物抑制細菌生長、產酸、黏附及促進礦化等的作用機制，研究天然藥物防齲效果[13]。

本實驗結果表明，地膚子粗提物的濃度為100 mg/mL時，雖然不能抑制變異鏈球菌的成長，但可抑制變異鏈球菌黏附及產酸。這與林秀仙等使用超臨界萃取地膚子油在高濃度時對金黃色葡萄球菌及鏈球菌等有抑菌作用的研究結果相似[14]。地膚子的化學成分復雜，主要有萜類及其皂苷、揮發油等[15]，其具體有效活性成分有待進一步篩選。另外，地膚子對變異鏈球菌合成葡聚糖、菌斑形成及牙體硬組織再礦化等方面的影響及其作用機制也有待進一步探索。