細胞穿膜肽PFV修飾紫杉醇/青蒿琥酯共載靶向膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究

王為 李學濤 孔亮 姜爽 羅一夫 王曉波

摘 要 目的：制備細胞穿膜肽PFV修飾紫杉醇（PTX）/青蒿琥酯（ART）共載靶向膠束，并考察其體外抗腫瘤活性。方法：按前期優化的工藝，采用薄膜水化法制備PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，并對其進行表征。以空白膠束作為空白對照，采用磺基羅丹明B法評價PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對人胃癌BGC-823細胞的毒性;以香豆素作為熒光探針取代PTX，制成相應的不同膠束，采用流式細胞儀和熒光顯微鏡測定和觀察BGC-823細胞對各膠束的攝取情況和靶向性;并通過Transwell小室法考察PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對BGC-823細胞侵襲的影響。結果：PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的平均粒徑為（51.30±3.95） nm，分散系數為0.19±0.01，Zeta電位為（0.21±0.02） mV，PTX、ART的包封率均高于90%，形態呈圓球形?？瞻啄z束對BGC-823細胞無明顯毒性，PTX膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對BGC-823細胞的半數抑制濃度分別為（3.09±0.22）、（1.93±0.24）、（1.11±0.15） ? ? ? μmol/L;不同膠束在BGC-823細胞核中的分布數量排序依次為PFV修飾香豆素/ART膠束>香豆素/ART膠束>香豆素膠束>空白對照，抑制細胞侵襲作用的大小依次為PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束>PTX/ART膠束>ART膠束>PTX膠束>空白對照。結論：制備的PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束符合《中國藥典》要求;其對BGC-823細胞具有較強的細胞毒性，可提高藥物的靶向性和細胞對藥物的攝取能力，并能抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。

關鍵詞 細胞穿膜肽;紫杉醇;青蒿琥酯;膠束;人胃癌BGC-823細胞;靶向作用;抗腫瘤作用

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To prepare cell penetrating peptide PFV-modified paclitaxel （PTX）/artesunate （ART） co-loaded targeting micelles， and to investigate in vitro anti-tumor activity. METHODS： According to optimal technology， PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles were prepared by membrane hydration method， and were characterized. Using blank micelle as blank control， sulforhodamine B （SRB） method was used to evaluate the toxicity of PTX micelles， ART micelles， PTX/ART micelles and PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles to human gastric cancer BGC-823 cells. The coumarin was used as fluorescent probe replacing PTX to prepare corresponding micelles. Then，the uptake of BGC-823 cells to corresponding micelles and targeting effect were observed and determined by flow cytometry and fluorescence microscope. The effects of PTX micelles， ART micelles， PTX/ART micelles and PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles on the invasion of BGC-823 cells were investigated by Transwell chamber method. RESULTS： Average particle size of PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles was （51.30±3.95） nm; PDI was 0.19±0.01， and Zeta potential was （0.21±0.02） mV. The encapsulation efficiency of PTX and ART were higher than 90%. The shape of micelles were spherical. The blank micelles had no obvious toxicity to BGC-823 cells. The IC50 value of PTX micelles， PTX/ART micelles and PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles to BGC-823 cells were （3.09±0.22）， （1.93±0.24）， （1.11±0.15） μmol/L， respectively. The distribution amount of different micelles in BGC-823 cell nucleus in the descending order were PFV-modified coumarin/ART micelles>coumarin/ART micelles>coumarin micelles>blank control. The order of inhibitory effect was PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles>PTX/ART micelles>ART micelles>PTX micelles>blank control. CONCLUSIONS： Prepared PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles are in line with the quality of Chinese Pharmacopoeia. It shows strong cytotoxicity to BGC-823 cells， can improve the drug targeting and the cell uptake， and inhibit the invasion and metastasis of BGC-823 cells.

KEYWORDS ? Cell-penetrating peptide; Paclitaxel; Micelles; Artesunate; Human gastric cancer BGC-823 cells; Targeting effects; Anti-tumor effect

胃癌是消化道腫瘤中發病率最高的惡性腫瘤[1]。目前，化療是胃癌的主要治療方式，但化療后殘余的癌細胞會通過侵襲作用導致腫瘤轉移，且化療藥物會增加機體的毒副反應，導致患者預后較差[2]。紫杉醇（PTX）具有較高抗癌活性，在臨床用于多種癌癥的治療，但溶解性低、生物利用度差、無選擇性分布是限制其臨床應用的主要原因[3]。提高PTX的靶向性以降低其毒副作用并抑制腫瘤細胞轉移顯得尤為重要。細胞穿膜肽（簡稱“PFV”）具有細胞穿透能力強的特點，并且能增加藥物在腫瘤部位的蓄積[4]。青蒿琥酯（ART）具有抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤侵襲轉移、增敏抗腫瘤化療藥物的作用[5-7]。膠束具有粒徑小和對機體毒性低等優點，可增加化療藥物的溶解度并提高化療藥物對腫瘤的被動靶向性[8-11]。為提高PTX的腫瘤靶向性及其對腫瘤細胞侵襲和轉移的抑制作用，本課題組前期優化工藝后采用薄膜水化法制備了PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，其中PFV用來提高細胞對藥物的攝取能力，PTX作為化療藥物，ART用來抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移[12]。本研究在前期研究基礎上，對所制膠束進行表征后并進一步考察PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的體外抗腫瘤作用，為膠束包載PTX的靶向給藥和ART抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的相關制劑開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FA1004型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）;SG3300H型超聲波清洗機（上海冠特超聲儀器有限公司）;RE52CS型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）;DZKW-S-4型恒溫水浴鍋（上海醫療器械公司醫療器械五廠）;HBS-1096A型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）;JEM-1200EX型透射電鏡（日本Tokyo公司）;Accuri C型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）;ZS90型激光散射粒徑測定儀（英國Malvern公司）;WJ-80B-Ⅱ型細胞培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）;SW-CJ-1D型超凈臺（上海滬凈醫療器械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

PTX原料藥（批號：MB1178，純度：≥99%）、ART原料藥（批號：J0101A，純度：≥98%）、TPGS1000（批號：MB2036）、胰蛋白酶、磺基羅丹明B（SRB）、青鏈霉素雙抗均購自大連美侖生物技術有限公司;RPMI 1640培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）;Soluplus兩親性接枝共聚物（德國BASF公司）;二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-PFV（DSPE-PEG2000-PFV）修飾膠束的靶向材料由遼寧中醫藥大學藥學院藥劑實驗室合成;三氯甲烷、甲醇等試劑均為分析純，水為娃哈哈牌純凈水。

1.3 細胞

人胃癌BGC-823細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。

2 方法與結果

2.1 膠束的制備

按照文獻方法[12]，精密稱取DSPE-PEG2000-PFV 1.5 mg、ART 2 mg、Soluplus 60 mg、TPGS1000 12 mg、PTX 0.5 mg于50 mL圓底燒瓶中，加5 mL三氯甲烷使溶解，然后在40 ℃水浴下減壓旋轉蒸發除去三氯甲烷。待燒瓶底部形成一層均勻白色膜時，加入磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4）5 mL，在35 ℃水浴下振搖11 min，再以微孔濾膜（0.22 μm）濾過2次，隨后將濾過的膠束溶液轉移至5 mL量瓶中，以PBS定容至刻度，即得PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束。同時，按照上述方法制備空白膠束（空白對照）、PTX膠束、ART膠束和PTX/ART膠束，其中空白膠束只添加處方量的Soluplus和TPGS1000，PTX膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000和PTX，ART膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000和ART，PTX/ART膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000、ART和PTX。

2.2 膠束的表征

按照本課題組前期建立的方法[12]測定膠束的包封率，采用激光散射粒徑測定儀和透射電鏡分別測定膠束的粒徑、多分散性指數（PDI）、Zeta電位并觀察其形態學特征，每個試驗重復3次。結果顯示，載藥膠束中PTX和ART的包封率均大于90%;5種膠束的粒徑在47～51 nm之間，其中PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的粒徑分布具有良好的集中性且高度集中在51 nm左右;5種膠束的PDI均小于0.20，Zeta電位均呈電中性;外觀形態為圓球形。膠束的包封率、粒徑、PDI和Zeta 電位測定結果見表1;PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的透射電鏡圖見圖1（其余膠束圖略）。

2.3 細胞培養

將BGC-823細胞接種到含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養（下同）。第2天換液，隔天傳代，采用4～6代細胞進行細胞試驗。

2.4 膠束對BGC-823細胞的毒性作用考察

采用SRB法測定膠束的細胞毒性作用。按“2.1”項下方法分別制備空白膠束（空白對照）、PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束和PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，各含藥膠束中PTX濃度均為10 μmol/L，ART濃度均為100 μmol/L。采用二倍稀釋法，以PBS（pH=7.4）為稀釋溶劑，使各膠束的藥物濃度分別為處方濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，作為系列稀釋倍數樣品進行試驗。將對數生長期的細胞接種至96孔板中（1.5×104 ? ? ? 個/孔），分為不同稀釋倍數的膠束給藥組，先用不含藥的培養基培養24 h后，吸棄培養基，然后加入相應的含藥培養基[180 μL/孔，其中膠束給藥量均為20 μL/孔]，繼續培養48 h。然后以10%三氯乙酸固定細胞，加入0.4%SRB染料染色22 min，再加入Tris堿液溶解混合后的染料染色25 min。最后，采用酶標儀測定各孔在540 nm波長下的吸光度（OD）值，并計算細胞存活率：[細胞存活率（%）=給藥組OD值/空白對照組OD值×100%]。試驗重復3次。采用GraphPad 6.0軟件計算不同膠束對細胞的半數抑制濃度（IC50）。采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

結果顯示，空白膠束對細胞無明顯毒性作用，PTX膠束、PTX/ART膠束和PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對細胞的IC50分別為（3.09±0.22）、（1.93±0.24）、（1.11±0.15） μmol/L（均以PTX計，下同），且PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對細胞的IC50顯著低于PTX膠束和PTX/ART膠束（P<0.05）。當膠束濃度為處方濃度的1/16～1（即PTX濃度為0.63～10 μmol/L）時，PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束組細胞的存活率較其他各組均顯著降低（P<0.05）;當膠束中PTX濃度為10 μmol/L時，對細胞的毒性作用最強，因此在后續試驗中均設定膠束中PTX的濃度為10 μmol/L。結果見圖2。

2.5 BGC-823細胞對膠束的攝取情況考察

以香豆素作為熒光探針考察細胞對膠束的攝取情況。以香豆素代替PTX，按“2.1”項下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束（香豆素的含量均為2 μmol/L[3]，其余藥物和輔料的用量不變），并同時制備空白膠束作為空白對照。取對數生長期BGC-823細胞接種至6孔板中（2.5×105個/孔），分為不同膠束給藥組，先用不含藥的培養基培養24 h后，棄培養基，然后加入新鮮含藥培養基[180 μL/孔，其中膠束給藥量均為20 μL/孔（含藥膠束中ART濃度均為100 μmol/L）]，繼續培養3 h。然后以PBS洗板，以0.25%胰蛋白酶消化細胞后加入0.5 mL PBS。采用流式細胞儀測定各組細胞熒光強度，該值越大，說明細胞對膠束的攝取越多。

結果顯示，空白對照組、香豆素膠束組、香豆素/ART膠束組、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束組細胞的熒光強度分別為（2.18±0.09）×104、（2.49±0.24）×106、（2.64±0.09）×106、（3.42±0.31）×106;其中，PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束的熒光強度最大，且顯著大于其他各膠束樣品（P<0.05），表明PFV修飾后可提高藥物的靶向性，結果見圖3。

2.6 膠束對BGC-823細胞的靶向性考察

以香豆素作為熒光探針考察膠束的靶向性。以香豆素代替PTX，按“2.1”項下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束;同法進行細胞分組、給藥，繼續培養3 h后，以PBS洗板，加入4%多聚甲醛固定細胞8 min，在避光處用Hoechst 33258對細胞進行染色。采用熒光顯微鏡觀察細胞中藥物的分布情況，其中藍色熒光區域代表BGC-823細胞核，綠色熒光區域代表香豆素，藍綠色熒光區域為細胞與香豆素分布的疊加處。

結果顯示，在各膠束樣品中，PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束在細胞中的熒光強度最大，說明藥物可選擇性地分布在細胞核內。各組細胞中熒光強度的大小順序為PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束組>香豆素/ART膠束組>香豆素膠束組>空白對照組，結果見圖4。

2.7 PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對BGC-823細胞侵襲的影響

采用Transwell小室法進行測定。按“2.1”項下方法分別制備空白膠束（空白對照）、PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束和PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，各含藥膠束中PTX濃度均為10 μmol/L，ART濃度均為100 μmol/L。取對數生長期BGC-823細胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化后，接種在Transwell小室中（1.5×105 ? 個/孔），分為不同膠束給藥組，各小室中加入相應含藥培養基[200 μL/室，給藥量為20 μL/室]。在24孔板中加入含10%胎牛血清的培養基（700 μL/孔），將上述Transwell小室放在24孔板中培養10 h后，用棉球擦去小室中未侵襲的細胞，并用4%多聚甲醛固定小室下方侵襲的細胞25 min，然后用0.1%結晶紫染色15 min。采用顯微鏡觀察，并隨機選取1個視野拍照，鏡下紫色信號的強度與侵襲通過小室基底膜的細胞數量成正比。

結果顯示，與空白對照組比較，ART膠束組、PTX/ART膠束組以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束組的紫色信號強度依次減弱，表明侵襲的細胞數量依次減少。各膠束對細胞的侵襲抑制作用強弱順序為PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束>PTX/ART膠束>ART膠束>PTX膠束>空白對照，結果見圖5。

3 討論

近年來，膠束作為化療藥物的運送載體在抗腫瘤方面的應用受到越來越多的關注，其疏水嵌段組成的聚合物膠束內核能夠為難溶性藥物提供貯藏空間，而疏水性化療藥物的溶解度也在親水外殼的共同作用下明顯提高[8]?；诖?，本課題組將化療藥PTX和ART共同包埋于膠束內，使這兩種藥物達到協同增效的目的。PFV是一種疏水性的電中性短肽，經PFV修飾的脂質體等遞藥系統能明顯增加細胞對藥物的攝取[4]。本課題組前期通過?；磻铣闪薉SPE-PEG2000-PFV，其可嵌入膠束中使PFV修飾于膠束外周。本研究制備的PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束呈圓球形，粒徑在51 nm左右，有良好的粒徑分布和形態，藥物的包封率均大于90%，符合2015版《中國藥典》（四部）的要求[13]。

體外細胞毒性試驗中，PTX的終濃度設置為10 ? ? ? ?μmol/L是為了保證在殺傷腫瘤細胞的前提下，還能保證本研究各項試驗中有足夠的細胞存活量;在ART的Transwell小室預試驗中，當ART的濃度為100 μmol/L時，恰能抑制細胞的侵襲和轉移，因此本研究在膠束的處方中設置ART的濃度為100 μmol/L。本研究結果顯示，空白膠束對BGC-823細胞無明顯細胞毒性，這提示膠束膜材安全性較高，可作為運送藥物的載體[14]。PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束中PTX濃度為0.63～10 ? ?μmol/L時，與其他膠束樣品比較具有更強的細胞毒性。

因PTX和ART都不具有熒光活性，所以在細胞攝取和膠束靶向性試驗中，本課題組選擇具有熒光活性的香豆素作為探針藥物。香豆素作為熒光探針在研究脂質體等給藥體系的藥物攝取情況中已有運用，具有簡便、易操作的特點[15]。本研究通過流式細胞儀和熒光顯微鏡對PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束進行定量和定性考察，發現香豆素的熒光強度在PFV修飾膠束組細胞中顯著增強，表明PFV修飾后可增加載藥膠束在腫瘤細胞中的分布，提高了藥物的腫瘤靶向性，并增強了腫瘤細胞對藥物的攝取。此外，本研究通過細胞侵襲試驗發現，載有ART的膠束均呈現出對細胞侵襲的抑制作用，這表明ART的加入可抑制BGC-823細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，本研究成功制備了PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，其具有較強的細胞毒性，能提高藥物的腫瘤靶向性和細胞對藥物的攝取能力，并且可抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。但由于試驗均在體外完成，并不能代表體內結果，在接下來的研究中，筆者將進一步展開PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的體內抗腫瘤作用研究。

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（收稿日期：2020-05-12 修回日期：2020-09-21）

（編輯：林 靜）