堿性蛋白酶水解紅豆粉的工藝優(yōu)化及產(chǎn)物抗氧化活性分析

楊 爽，董艷嬌，肖 瑜，張金寶，王 潔

（1. 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院 食品工程學(xué)院分子營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130052；2. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

紅豆是我國的傳統(tǒng)谷物之一，也是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品。紅豆?fàn)I養(yǎng)價值豐富，每100 g 含有約20 g蛋白質(zhì)，0.5 g 脂肪，58.5 g 糖，4.9 g 粗纖維，23.5 g膳食纖維，0.3 mg 維B1、0.11 mg 維B2[1]。紅豆被認(rèn)為是一種高蛋白質(zhì)、低脂肪的食物。紅豆常被加工成多種食品，如紅豆飲料[2]、酸奶[3]、酒類[4]和紅豆沙[5]等，都受到廣大消費(fèi)者的喜歡。同時，紅豆也是藥用原料，在藥用價值方面研究發(fā)現(xiàn)，紅豆皂苷和膳食纖維具有良好的調(diào)節(jié)血壓、血糖，以及利尿、通便、解酒、預(yù)防肝硬化和結(jié)石等作用[6]。我國關(guān)于紅豆的研究主要集中在黃酮[7]、多酚[8]等多種生物活性成分提取及功能活性研究。而作為紅豆主要成分之一，紅豆蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源，其氨基酸種類齊全，必需氨基酸達(dá)到甚至高于FAO/WHO 的要求[9]。與此同時，其蛋白質(zhì)水提物獲得的肽被證明具有抗菌、抗腫瘤[10]活性。雖然紅豆蛋白是良好的植物蛋白原料，但紅豆目前的加工程度較低，并未得到充分利用開發(fā)。

近年來，越來越多研究者通過酶水解蛋白質(zhì)制備功能活性肽，來實(shí)現(xiàn)高效利用蛋白資源的目的。有些蛋白質(zhì)其組成中部分序列無活性，經(jīng)過酶解后，釋放出來某些序列，才可表現(xiàn)出生理活性，酶水解獲得的肽通常由2～20 個氨基酸殘基組成，且相關(guān)研究表明其水解產(chǎn)物在營養(yǎng)價值方面，其吸收和利用率優(yōu)于未水解的蛋白質(zhì)，更能發(fā)揮蛋白質(zhì)的營養(yǎng)作用[11-12]。堿性蛋白酶被廣泛用于蛋白質(zhì)的水解，已有報道關(guān)于綠豆肽[13]、花生肽[14]、黑豆肽[15]、大豆肽[16]等肽類的水解工藝研究和功能特性分析。我國有豐富的雜糧品種，紅豆作為我國雜糧的一個重要的品種，對其深加工研究卻是非常少。所以，試驗(yàn)以堿性蛋白酶對紅豆粉進(jìn)行水解并對其水解產(chǎn)物抗氧化活性進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)紅豆和紅豆水解物的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆，購自超市，蛋白質(zhì)含量測定為21.6%；堿性蛋白酶（酶的活力數(shù)值為1.0×105U/mL），豐瑞生物科技有限公司提供；氫氧化鈉、鹽酸等，均為分析純。

粉碎機(jī)，速鋒有限公司產(chǎn)品；HH-W600 型恒溫水浴鍋，安慶潔佳儀設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)流程

紅豆→機(jī)器粉碎→過篩120 目→調(diào)節(jié)溫度、pH 值、加酶量和酶解時間→水解→沸水浴滅酶10 min→測水解度。

1.2.2 紅豆肽的酶解工藝

（1） 單因素試驗(yàn)。①溫度。固定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，酶加入量250 U/mL，時間3.5 h，在pH 值為10.0 的條件下，于45，50，55，60，65 ℃的水浴溫度環(huán)境中酶解，測定水解度。②pH 值。固定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，酶加入量250 U/mL，時間3.5 h，溫度55 ℃，測定不同的pH 值（7.0，8.0，9.0，10.0，11.0）條件下水解度。③加酶量。固定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，在pH 值為10.0，時間3.5 h，溫度為55 ℃的條件下，測定不同加酶量（100，150，200，250，300 U/mL） 條件下水解度。④時間。固定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，pH 值10.0，溫度55 ℃，加酶量250 U/mL，再以時間2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h 分別測定水解度。

（2） 正交試驗(yàn)。以水解度作為評價指標(biāo)，以下的4 個因素（溫度、pH 值、加酶的量和時間） 為自變量，選擇四因素三水平的設(shè)定，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而進(jìn)一步優(yōu)化水解條件。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計

（3） 蛋白水解度（DH） 的測定。參考袁斌等人[17]的方法，用pH-stat 法測水解度，計算如下：

式中：B——?dú)溲趸c用量；

Nb——?dú)溲趸c質(zhì)量濃度，mg/mL；

α——校正系數(shù)，計算如下：

pK 隨溫度變化，根據(jù)Gibbs-Helmholz 方程計算獲得；

式中：Mp——底物蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；

Htot——每克蛋白質(zhì)底物的肽鍵毫摩爾數(shù)，紅豆蛋白為7.12。

（4） 水解物的制備。水解結(jié)束后，取出沸水浴滅酶10 min，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心20 min，取上清液冷凍干燥后密封保存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

（5） 抗氧化性的測定。

①DPPH 自由基的清除能力。根據(jù)Xia Y 等人[18]的方法略作修改，分別配置2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取0.5 mL 樣品液加0.1 mmol/L DPPH 無水乙醇0.5 mL，避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm 處測定吸光度，無水乙醇DPPH 為對照，空白為無水乙醇。計算公式如下：

式中：As——樣品吸光度；

Ab——空白吸光度；

Ac——對照吸光度。

②羥基自由基（·OH） 清除能力。參考Halliwell B[19]的方法，分別配置2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取0.5 mL 加0.5 mol/L FeSO4和H2O2反 應(yīng)10 min，加0.5 mL 6.0 mmol/L 水楊酸靜置30 min，于波長510 nm測定吸光度（As），去離子水為空白（Ab），水楊酸和樣品為對照（Ac）。計算公式如下：

式中：As——樣品吸光度；

Ab——空白吸光度；

Ac——對照吸光度。

③還原力測定。參考Lu R R 等人[20]的方法，分別配置2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取0.5 mL 樣品液，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，于50 ℃下反應(yīng)20 min，加10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，取0.5 mL 上清液加等體積去離子水，加0.1% FeCl3溶液0.4 mL （W/V），在50 ℃下反應(yīng)10 min，于波長700 nm 處測定吸光度為還原力，空白為去離子水。

④Fe2+螯合能力。分別配置質(zhì)量濃度為2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取1 mL 加2.0 mL 氯化亞鐵和菲洛嗪反應(yīng)10 min，于波長562 nm 處測定吸光度（As）。去離子水代替樣品為空白（Ac），計算公式如下：

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

每個試驗(yàn)至少做3 次平行試驗(yàn)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析與相關(guān)性分析，使用OriginPro 8.5 軟件制作分析圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度對水解度的影響

酶解溫度對蛋白水解度的影響見圖1。

由圖1 可以看出，酶解溫度在45～55 ℃，水解度隨酶解溫度升高而增大，當(dāng)酶解溫度大于55 ℃之后，隨著酶解溫度提高水解度發(fā)生了降低的情況。出現(xiàn)這種情況是因?yàn)槊傅幕钚院蜏囟扔嘘P(guān)[21]，當(dāng)溫度高于酶的最適反應(yīng)溫度，酶的活性降低。

2.2 pH 值對蛋白水解度的影響

pH 值對蛋白水解度的影響見圖2。

由圖2 可以看出，隨著pH 值的增大，水解度在圖中總體看來呈現(xiàn)上升趨勢，酶的反應(yīng)活性強(qiáng)度和pH 值的大小是有關(guān)系的。如圖2 所表現(xiàn)的pH 值為11 時，水解度到達(dá)了試驗(yàn)的最大值為19%，并逐漸趨于平緩。綜合考慮生產(chǎn)成本及實(shí)際生產(chǎn)所需條件，后續(xù)正交試驗(yàn)選擇的pH 值為9～11。

2.3 加酶量對水解度的影響

加酶量對蛋白水解度的影響見圖3。

由圖3 可以看出，隨加酶量的增大，水解度也在圖中總體出現(xiàn)增大的變化。在加酶量100～250 U/mL下，隨著酶量增加水解度不斷增加。而當(dāng)加酶量為300 U/mL，水解度降低，這說明加酶量過大時不利于水解反應(yīng)，產(chǎn)物中可能存在抑制酶作用的成分[22]，反應(yīng)不再進(jìn)行，從而使水解度發(fā)生下降。

2.4 酶解時間對水解度的影響

酶解時間對蛋白水解度的影響見圖4。

由圖4 可以看出，酶解時間對水解度有明顯的影響（p＜0.05），在2.5～3.5 h 時，水解度隨酶解時間的延長逐漸增加；在3.5 h 時，水解度最高為17.8%。而進(jìn)一步延長酶解時間，水解度不再增大而是出現(xiàn)降低現(xiàn)象。

2.5 最佳酶解工藝條件的確定

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2 可以看出，在測定影響水解度的因素試驗(yàn)中，4 個因素對水解度的影響主要程度依次為酶用量＞pH 值＞時間＞溫度。由正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)極差分析可知，最好的組合是A2B3C2D2，但表2 中4 號試驗(yàn)組A2B1C2D3的結(jié)果是最高的，為19.4%，和優(yōu)選組合不一致，然后用優(yōu)選組合的結(jié)果A2B3C2D2與第4 號組進(jìn)行再一次的試驗(yàn)求證，求證結(jié)果顯示優(yōu)選組合方案A2B3C2D2水解度是20.67%，所以最好的組合是A2B3C2D2，即溫度55 ℃，pH 值11，加酶量250 U/mL和時間3.5 h，最適用于紅豆的水解。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 抗氧化活性

不同質(zhì)量濃度水解物見圖5。

不同質(zhì)量濃度樣品均顯示了對DPPH 自由基有良好的清除能力（20.95%～33.09%），且樣品質(zhì)量濃度與DPPH 自由基清除率密切相關(guān)。羥基自由基可激活脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，與幾乎所有相鄰的生物分子可發(fā)生反應(yīng)。這種損傷可導(dǎo)致多種疾病，因此它的清除是預(yù)防食物腐敗和某些疾病發(fā)生的最有效的方法之一[22]。紅豆水解物具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力（30.91%～54.6%），可用于預(yù)防食物腐敗，使其免受羥基氧化的危害。圖5（c）中顯示了紅豆水解物Fe2+螯合能力，F(xiàn)e2+螯合能力隨著質(zhì)量濃度增加，從15.94%增加到30.01% （p＜0.05）。紅豆水解物具有較好的金屬離子結(jié)合能力。圖5（d） 顯示了水解物的還原力，如圖所示，紅豆水解物具有一定的還原能力（0.17%～0.3%），高于大麥谷蛋白酶解獲得的水解產(chǎn)物還原力（0.121，2 mg/mL）[18]。以上結(jié)果表明，紅豆水解物具有良好的抗氧化能力，且抗氧化活性與質(zhì)量濃度相關(guān)。

3 結(jié)論

選擇堿性蛋白酶水解紅豆，制備水解物，并分析其水解產(chǎn)物抗氧化活性，以期提高紅豆資源利用率。結(jié)果表明，堿性蛋白酶最適水解條件為溫度55 ℃，pH 值11，加酶量250 U/mL 和酶解時間3.5 h，此時蛋白水解度20.67%。在此參數(shù)下獲得的水解物的DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力、Fe2+螯合力和還原能力，隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，表明堿性蛋白酶水解紅豆獲得的水解物具有較好的抗氧化活性，其可作為一種潛在的抗氧化多肽進(jìn)行開發(fā)。