噴霧干燥可控制備生物玻璃微球及其體外生物活性研究

胡亞萍,田正芳,朱 敏,朱鈺方

(1. 上海理工大學 材料科學與工程學院,上海 200093; 2. 黃岡師范學院 化學化工學院,催化材料制備及應用湖北省重點實驗室,湖北 438000)

SiO2-CaO-P2O5體系的硅酸鹽基生物玻璃(Bioglass,BG)能與人體體液發生化學反應而與骨組織形成界面結合[1]。BG具有優異的生物相容性、成骨能力和降解性能,因此自1969年被發明以來,已得到廣泛應用和深入研究[1-4]。

傳統制備BG粉體的方法有高溫熔融法、溶膠-凝膠法等。高溫熔融法制備BG粉體具有高溫耗能、混料不勻和生物活性較低等特點[5-6]。因此,為了克服這些缺點,研究人員提出溶膠-凝膠法,可在室溫下成功制備出BG粉體[6-9]。與高溫熔融法相比,溶膠-凝膠法制備的BG粉體生物活性更好,但其存在制備周期長、需用有機溶劑[10],且塊狀BG還需要進一步研磨等缺點。

噴霧干燥是一種快速加熱和冷卻的連續過程。在制備微球方面,噴霧干燥法具有耗時短、可批量生產、干燥過程還能方便調節微球大小和形狀等優點[11-17]。例如,Yamauchi等[11]采用結構導向劑F127、1,2-雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷和正硅酸四乙酯混合后噴霧干燥制備了具有良好球形形貌和粒徑在0～2.5 μm的有機硅微球。Fiorilli等[12]采用正硅酸四乙酯為原料預水解后結合三嵌段表面活性劑P123進行噴霧干燥制備出粒徑為2～5 μm,孔徑約8 nm的二氧化硅微球。近年來,研究人員采用噴霧干燥法替代傳統工藝制備BG粉體。例如,Shih等[18]采用溶膠-凝膠法結合噴霧干燥可快速制備平均孔徑為6 nm,比表面積為260 cm2/g的BG微球。Ostomel等[19]采用三嵌段表面活性劑(P123)、正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸鈣和乙醇溶劑混合后噴霧干燥,成功制備出球形介孔BG微球,顆粒粒徑為1 nm～1 mm,表現出良好的體外誘導磷灰石沉積能力。Arcos等[20]采用不同的結構導向劑(P123、CTAB、F127)與正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸鈣和乙醇溶劑制備前驅體溶液,噴霧干燥后制備得到不同孔徑的BG微球,發現氧化鈣含量的提高有利于提高其生物活性。雖然上述研究都表明前驅體溶液結合噴霧干燥方法可制備不同的BG微球,但是前驅體溶液通常含有大量易燃溶劑(主要為體積含量約60%的乙醇),前驅體溶液霧化干燥過程需考慮安全問題而不能長時間連續工作,限制了BG粉體的連續批量化制備。

因此,為克服高溫耗能、制備周期長、原料成本高、連續批量制備不安全等缺點,本研究提出以水溶液作為溶劑,在酸性條件下制備BG前驅體溶液,采用噴霧干燥方法快速、連續、可控制備球形BG微球,研究了噴霧干燥過程中不同工藝參數(進氣風量、前驅體溶液濃度和進料速率)對BG微球粒徑的影響; 通過調節原料配比制備不同化學組成的BG微球,研究了不同化學組成BG微球的體外誘導磷灰石沉積能力。

1 實驗方法

1.1 材料

硝酸(HNO3,≥68%)、正硅酸四乙酯(TEOS,98%)、磷酸三乙酯(TEP,99.8%)、氯化鈉(NaCl,99.5%)、碳酸氫鈉(NaHCO3,99.8%)、氯化鉀(KCl,99.8%)、磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O,99%)、氯化鎂(MgC12·6H2O,98%)、鹽酸(HCl,36%～38%)、氯化鈣(CaC12,96%)、硫酸鈉(Na2SO4,99%)和三羥基氨基甲烷(NH2C(CH2OH)3,99%)購自中國國藥化學試劑有限公司(中國上海); 硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O,99%)購自天津市大茂化學檢測廠。所有化學藥品未經進一步純化。

1.2 制備方法

1.2.1 制備前驅體溶液

室溫下,取一定量的去離子水,滴加硝酸調節水溶液至pH為2,接著往水溶液中加入TEOS并磁力攪拌至溶液透明澄清[21],然后將TEP加入上述澄清溶液并攪拌30 min,最后加入四水合硝酸鈣(CaNT)并攪拌20 min,得到澄清的前驅體溶液備用。配制的不同濃度前驅體溶液如表1所示,不同化學組成的前驅體溶液如表2所示。

1.2.2 制備BG微球

采用Buchi-290噴霧干燥儀(噴頭直徑2.8 mm)噴霧干燥BG前驅體溶液制備BG微球。固定設置儀器的循環率為100%,進口溫度為220 ℃。前驅體溶液濃度分別為5wt%、15wt%、25wt%和35wt%; 進氣風量為283、439、667和1052 L/h; 進料速率為1.5、3、4.5和6 mL/min。將不同噴霧干燥工藝條件下收集得到的微球置于馬弗爐中,從室溫開始以2 ℃/min的速率升溫至700 ℃并保溫5 h,自然冷卻得到BG微球。

1.2.3 體外誘導磷灰石沉積

為研究不同化學組成BG微球的體外生物活性,本研究采用實驗室自制的模擬體液(SBF)進行體外礦化實驗以驗證其體外誘導磷灰石沉積能力。SBF中各無機離子的濃度與人體血漿中各離子的濃度相近,根據Kukubo方法配制[22]。實驗將BG微球以0.1 g/100 mL的比例浸泡SBF,靜置于37 ℃烘箱中,分別浸泡2 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d后取出,過濾干燥得到礦化的BG微球。采用掃描電鏡和附帶的能譜儀觀察和分析BG微球表面的羥基磷灰石(HA)生長情況; 用粉末X射線衍射儀分析物相組成; 用紅外光譜儀分析化學結構變化。

為了研究不同化學組成BG微球對周圍pH環境的影響,將BG微球以0.1 g/100 mL的比例浸泡于Tris-HCl(pH7.4)溶液并靜置于37 ℃烘箱中,分別浸泡2 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d后測試溶液的pH,三組平行實驗同時進行。

1.3 樣品表征

用掃描電鏡(SEM,Zeiss SIGMA300)觀察BG微球形貌,用所附能譜儀(EDS)分析微球元素成分、組成及分布,另用SEM照片配合Imaje J軟件對BG微球粒徑進行統計; 用粉末X射線衍射儀(XRD-6100,SHIMADZU)和紅外光譜儀(FT-IR,Nicolet 6700)分別對BG微球進行物相和化學結構分析。

2 結果與討論

2.1 BG微球結構表征

煅燒處理后77SBG微球的SEM、粉末XRD圖譜以及能譜儀分析得到的元素分布如圖1所示。由圖1(A)可以看出,噴霧干燥法得到的BG粉體為光滑的球形顆粒,粒徑分布較窄; 粉末XRD圖譜顯示BG粉體只在2θ=15°～35°范圍有寬化的饅頭峰,表明700 ℃煅燒處理后的BG粉體為無定型態(圖1(B));能譜儀分析的元素分布圖表明BG微球的O,Si,Ca,P元素分布均勻(圖1(C))。由此可知,采用噴霧干燥BG前驅體溶液方法可以制備化學組成分布均勻、粒徑分布較窄的無定型態BG微球。

表1 不同質量濃度的前驅體溶液的配制Table 1 Preparation of precursor solutions with different mass concentrations

表2 不同化學組成BG微球的理論、實際化學組成和反應物用量Table 2 Theoretical and measured chemical composition,amounts of the reactants of BG microspheres

圖1 噴霧干燥法制備的77SBG微球的SEM照片(A)、粉末XRD圖譜(B)以及元素分布圖(C)Fig. 1 SEM image (A),XRD pattern (B) and elemental mappings (C) of 77SBG microspheres obtained via spray-drying method

2.2 進氣風量對BG微球粒徑的影響

圖2是固定進料速率為6 mL/min時,濃度為5wt%的前驅體溶液通過調節進氣風量分別為283、439、667和1052 L/h時得到BG微球的SEM照片和相應的粒徑分布直方圖。當進氣風量為283 L/h時,粒徑范圍為5～30 μm; 而當進氣風量為1052 L/h時,粒徑幾乎都在10 μm以下。說明當進料速率恒定不變時,單位時間內進氣風量越大,BG微球的粒徑變小,而且粒徑分布變窄。

圖2 進料速率為6 mL/min時,5wt%的前驅體溶液在進氣風量分別為283 (A1,A2)、439 (B1,B2)、667 (C1,C2)和1052 L/h(D1,D2)時得到的77SBG微球的SEM照片以及運用Imaje J統計得到的粒徑直方圖Fig. 2 SEM images and the particle size histogramms obtained by Imaje J statistics of 77SBG microspheres prepared with 5wt% precursor solution at inlet air volume of 283 (A1,A2),439 (B1,B2),667 (C1,C2) and 1052 L/h(D1,D2) when the feed rate was 6 mL/min

這是因為單位時間內通過噴嘴風量增大,氣流速率加快,會將進料的前驅體溶液快速沖散,從而使得霧化液滴尺寸變小。另一方面,氣流速率加快將增加快速轉移到溶液流中的能量(動能),這使得氣液接觸面積增大,被霧化液滴很快達到飽和,成核速率加快; 隨著成核數量增多,BG微球沉積加快,BG微球的整體粒徑減小,粒徑范圍也相應變窄[23-25]。因此,進氣風量的增加與霧化流的液滴尺寸成反比,與最終得到的BG微球的整體粒徑大小成反比。

2.3 前驅體溶液濃度對BG微球粒徑的影響

圖3是進料速率為6 mL/min、進氣風量為667 L/h,前驅體溶液濃度分別為5wt%、15wt%、25wt%和35wt%時得到BG微球的SEM照片和粒徑分布直方圖。由圖可以看出,前驅體溶液濃度為5wt%時,BG微球的粒度范圍在15 μm以下; 而當前驅體溶液濃度增加到35wt%時,BG微球的粒度范圍擴大到40 μm以下。表明當前驅體溶液濃度增高,BG微球整體粒徑變大,同時粒徑分布變寬。

圖3 進氣風量為667 L/h,5wt% (A1,A2)、15wt% (B1,B2)、25wt% (C1,C2)和35wt% (D1,D2)的前驅體溶液在進料為6 mL/min時77SBG微球的SEM照片及運用Imaje J統計得到的粒徑直方圖Fig. 3 SEM images and the particle size histogramms obtained by Imaje J statistics of 77SBG microspheres prepared with 5wt% (A1,A2),15 wt% (B1,B2),25wt% (C1,C2) and 35wt% (D1,D2) precursor solutions at the feed rate of 6 mL/min when the inlet air volume was 667 L/h

當其他工藝參數不變時,前驅體溶液濃度增加,造成溶液粘度增大,使得霧化液滴變大,導致氣液接觸面積縮小,傳熱效率降低。因此,前驅體溶液濃度增大,BG微球的粒徑變大且粒度分布也變寬。前驅體溶液濃度增大,BG微球會出現小顆粒團聚附著在大顆粒表面的現象,這可能由于溶液粘度增大使得霧化液滴不均勻所致。

另一方面,從溶劑去離子水的含量分析,當其他工藝參數不變時,前驅體溶液濃度越小,意味著前驅體溶液中的去離子水含量越大。噴霧干燥形成BG微球的球形形貌很大程度上取決于溶液的表面張力[26]。在噴霧干燥過程中,每種原料都會降低霧化液滴的表面張力,從而影響最終顆粒的形貌。相反地,去離子水具有大的表面張力(72.7 mN/m),高含量的水會增加霧化液滴整體的表面張力而有利于形成BG微球的球形形貌。因此,去離子水含量越高,噴霧干燥過程中霧化液滴的表面張力越大,霧化液滴干燥固化成顆粒時發生的變形越小,使得形成的BG微球球形度越好,整體顆粒變小且粒徑分布也會變窄(顆粒更均勻)。

2.4 進料速率對BG微球粒徑的影響

圖4是前驅體溶液濃度為5wt%、進氣風量為1052 L/h,調節進料速率分別為1.5、3、4.5和6 mL/min時得到BG微球的SEM照片和粒徑分布直方圖。當進料速率增加時,得到的BG微球的粒徑范圍主要為10 μm以下,但是通過Imaje J統計的粒度分布直方圖可以看出,BG微球的中間粒徑會隨著進料速率的增加而略有增大。這是因為在噴霧干燥過程中,進氣風量不變,增大進料速率意味著單位時間內需要更多能量將前驅體溶液霧化成液滴并干燥。所以進料速率越大,霧化液滴的尺寸也會緩慢增大,液滴干燥后形成的BG微球的中間粒徑也會略有增大。因此,噴霧干燥過程中進料速率對BG微球的粒徑范圍影響較小,但是進料速率增大會使BG微球的中間粒徑略有增大。

圖4 進氣風量為1052 L/h時,5 wt%的前驅體溶液在進料速率為1.5 mL/min (A1,A2)、3 mL/min (B1,B2)、4.5 mL/min (C1,C2)和6 mL/min(D1,D2)時得到的77SBG微球的SEM照片及運用Imaje J統計得到的粒徑直方圖Fig. 4 SEM images and the particle size histogramms obtained by Imaje J statistics of 77SBG microspheres prepared with the 5wt% precursor solution at the feed rates of 1.5 mL/min (A1,A2),3 mL/min (B1,B2),4.5 mL/min (C1,C2) and 6 mL/min (D1,D2) when the inlet air volume was 1052 L/h

2.5 不同化學組成BG微球的結構表征

圖5是58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球在700 ℃煅燒處理后的SEM照片。可以看出,不同化學組成的前驅體溶液都能采用噴霧干燥方法制備得到表面光滑的BG微球,并且相同的噴霧干燥過程得到粒徑范圍相似的BG微球。圖6是58SBG 68SBG、77SBG和86SBG微球在700 ℃煅燒處理后的XRD圖譜和FT-IR圖譜。由XRD圖譜可以看出,86SBG和77SBG微球為典型的無定型態生物玻璃,而68SBG微球出現了較弱的Ca2SiO4(PDF#86-0399)物相寬化衍射峰,58SBG則顯示出明顯的Ca2SiO4衍射峰,表明隨著Ca/Si比例的增大,700 ℃煅燒處理得到的BG微球由完全的無定型態到逐漸有Ca2SiO4物相生成。由FT-IR圖譜可看出,58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球在800和1083 cm-1左右處出現了較強的Si-O-Si的伸縮振動峰; 在460 cm-1左右處出現了Si-O-Si的彎曲振動峰;58SBG和68SBG微球在590 cm-1左右處出現微弱的肩峰屬于無定型態P-O的彎曲振動雙峰; 從圖中可看出四種組分的BG微球在3500 cm-1左右處出現了-OH峰,這是吸收了空氣中水分的緣故。另外,58SBG微球在1480 cm-1處出現了CO32-的振動峰,這是因為相對于68SBG、77SBG、86SBG微球、58SBG微球氧化鈣含量最大,表征時暴露在空氣中更容易吸收水分和二氧化碳的緣故。

圖5 58SBG(A1,A2)、68SBG(B1,B2)、77SBG(C1,C2)和86SBG(D1,D2)微球經700 ℃煅燒處理后的SEM照片及運用Imaje J統計的粒徑分布直方圖Fig. 5 SEM images and the particle size histogramms obtained by Imaje J statistics of 58SBG (A1,A2),68SBG (B1,B2),77SBG (C1,C2) and 86SBG (D1,D2) microspheres after calcination at 700 ℃

2.6 不同化學組成BG微球的體外誘導磷灰石沉積能力

圖7是58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球在SBF中浸泡7 d后的SEM照片和EDS分析圖譜。由SEM照片可以看出,原本光滑的BG微球表面都覆蓋了一層厚厚的沉積物。根據EDS能譜分析得到58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球的Ca/P比值分別為2.048、1.597、1.520和1.712,這些比值都較接近于羥基磷灰石的Ca/P=1.67,表明BG微球表面的沉積物為羥基磷灰石。因此,噴霧干燥前驅體溶液制備的BG微球具有良好的體外誘導磷灰石沉積能力,主要是因為快速加熱和快速冷卻的噴霧干燥過程使得制備的BG顆粒的表面保留了更多的亞穩硅氧烷基團[18],而這些基團則充當成核位點有助于羥基磷灰石形成[9]。

圖8為58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球在SBF中浸泡不同時間前后的XRD圖譜。可以看出,不同化學組成的BG微球在SBF中浸泡不同時間后在2θ=25.8°、31.7°、39°和47°處都出現了羥基磷灰石的特征衍射峰(PDF#09-0432),表明不同化學組成的BG微球都具有體外誘導磷灰石沉積能力。另一方面,不同化學組成的BG微球礦化生成羥基磷灰石的能力有所不同。其中,86SBG微球在礦化3 d后出現明顯的羥基磷灰石特征衍射峰,而58SBG、68SBG和77SBG微球則在礦化4 h后就出現了羥基磷灰石的特征衍射峰,并且隨著礦化時間延長,羥基磷灰石的特征衍射峰強度逐漸增強; 58SBG微球在浸泡5 d后出現了較強的CaCO3物相衍射峰[27],這歸因于58SBG微球表面較高的Ca/P比使58SBG微球溶于SBF后的鈣離子溶出較多,在SBF中礦化形成羥基磷灰石的同時還形成了CaCO3。

圖7 58SBG(A)、68SBG(B)、77SSBG(C) 和 86SBG(D)微球在SBF中浸泡7 d后的SEM照片和EDS分析圖譜Fig. 7 SEM images and EDS analysis of 58SBG (A),68SBG (B),77SSBG (C),and 86SBG (D) microspheres after soaking in SBF for 7 d

圖8 58SBG(A)、68SBG(B)、77SSBG(C)和86SBG(D)微球在SBF中浸泡不同時間前后的廣角XRD圖譜Fig. 8 Wide-angle XRD patterns of 58SBG (A),68SBG (B),77SSBG (C) and 86SBG (D)microspheres before and after soaking in SBF for different periods

圖9為58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球在SBF中浸泡不同時間前后的FT-IR譜圖。可以看出,不同化學組成的BG微球在SBF中浸泡不同時間后,在560和610 cm-1左右都出現了晶態的P-O彎曲振動雙峰; 在1033 cm-1附近出現P-O伸縮振動峰,而且隨著礦化時間延長,振動峰強度也逐漸增強,表明BG微球在礦化過程中,羥基磷灰石在BG微球表面的逐漸形成和晶化。另一方面,從圖9中還可以觀察到58SBG微球浸泡SBF后在1410和1450 cm-1附近出現CO32-振動峰[28-29],隨著浸泡時間延長,其振動峰更明顯; 不僅如此,在浸泡2 d時,明顯觀察到在870 cm-1左右也出現CO32-中C-O振動峰,這表明58SBG微球表面礦化形成碳酸羥基磷灰石[30-31]; 同理也可看出68SBG和77SBG微球在浸泡3 d時,在1410和1450 cm-1附近也出現比較微弱的CO32-振動峰,表明在68SBG和77SBG微球的表面也生成很少量的碳酸羥基磷灰石。

圖9 58SBG(A)、68SBG(B)、77SSBG(C)和86SBG(D)微球在SBF中浸泡不同時間前后的FT-IR譜圖Fig. 9 FTIR spectra of 58SBG (A),68SBG (B),77SBG (C) and 86SBG (D) microspheres before and after soaking in SBF for different periods

圖10是58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球浸泡Tris-HCl溶液中的pH變化曲線。由圖可以看出,不同組成的BG微球浸泡Tris-HCl溶液后,其溶液pH隨著浸泡時間的延長而升高,且浸泡小于24 h的pH均增大較快,隨后緩慢增大,最終pH分別穩定在7.63、7.73、8.49和9.29左右。其中,58SBG微球在浸泡前24 h增加最快,最終達到的pH最高。這主要因為58SBG微球的Ca含量最大,當BG微球浸泡在Tris-HCl溶液中后,微球會發生降解并溶解出大量的Ca2+,而Ca2+會在溶液中發生水化反應產生OH-,從而使溶液pH升高而呈現堿性環境[32]。

3 結論

本研究以正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯和四水硝酸鈣為原料,采用噴霧干燥前驅體溶液方法可控制備出球形、組成分布均勻且無定型的BG微球。通過調節噴霧干燥過程中的工藝參數(進氣風量、前驅體溶液濃度和進料速率)可得到粒徑可控的BG微球。進氣風量增大,BG微球的整體粒徑減小、粒徑分布變窄; 前驅體溶液濃度增大,BG微球的整體粒徑增大、粒徑分布變寬; 進料速率增大,BG微球的整體粒徑略有增大、粒徑分布基本不變。另一方面,噴霧干燥方法還可以制備不同化學組成的BG微球,且都具有良好的誘導磷灰石沉積能力,BG微球中鈣含量增加有利于提高BG微球的體外誘導磷灰石沉積能力。因此,本研究提出的噴霧干燥法制備BG微球可實現粒徑、化學組成可控并有望快速、批量制備BG微球。

圖10 58SBG、68SBG、77SBG和86SBG微球在Tris-HCl溶液中浸泡不同時間的pH變化曲線Fig. 10 pH changes of Tris-HCl solutions after 58SBG,68SBG,77SBG and 86SBG microspheres soaking in Tris-HCl for different periods