膽管癌miR-551b表達變化的臨床意義及其靶基因生物信息學分析

劉學停，蔡 軍，孫艷軍，孫登群

膽管癌是惡性程度極高的一類消化系統惡性腫瘤，臨床上所指的膽管癌是肝外膽管癌，包括肝門部膽管癌和遠端膽管癌。因為疾病的早期診斷難度大、腫瘤的惡性程度高、局部解剖特點復雜，膽管癌的根治性切除率較低、預后較差，術后5年總體生存率不足5%[1,2]。目前關于膽管癌發病機制的認知不足，已有研究證實多種原癌基因、抑癌基因在膽管癌中異常表達[3-6]，但調控原癌基因、抑癌基因表達的機制仍有待探究。微小RNA(microRNA，miR)是具有廣泛生物學功能的非編碼小分子RNA，對多種原癌基因、抑癌基因的表達具有調控作用并在多種消化道惡性腫瘤的發生發展中起關鍵作用。膽管癌相關的細胞實驗表明，miR-155b能夠靶向原癌基因細胞周期素D1(cyclinD1)并抑制膽管癌細胞的生長，提示miR-155b可能參與膽管癌的發生發展[7]。為了明確miR-155b在膽管癌發生及病情轉歸中的作用，本研究探究了膽管癌中miR-551b表達變化的臨床意義并采用生物信息學的方法分析了miR-551b的靶基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014-10至2018-10在我院行膽管癌根治術的78例患者作為膽管癌組，納入標準：(1)經術后病理診斷為膽管癌；(2)臨床和病理資料完整；(3)隨訪資料完整；(4)患者知情同意。排除標準：(1)術前接受過放化療；(2)既往有其他惡性腫瘤病史。另取同期因膽管結石行Roux-en-Y膽腸吻合術的40例患者作為對照組，術中留取正常膽管組織。研究經醫院倫理委員會批準。膽囊癌組中男42例，女36例，年齡39～72歲，平均(51.49±12.92)歲；對照組中男23例，女17例，年齡32～71歲，平均(48.95±13.12)歲。兩組間一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 miR-551b表達的熒光定量PCR檢測 取膽管癌組織和正常膽管組織，采用天根公司生產的試劑盒進行實驗，按照miRNA提取分離試劑盒的說明書進行操作、分離組織中的miRNA，按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒的說明書進行操作、將miRNA反轉錄為cDNA，按照miRNA熒光定量檢測試劑盒的說明書配置PCR反應體系，按照95 ℃預變性3 min后95℃ 5 s、60 ℃ 15 s重復40個循環，軟件生成循環曲線及循環閾值(cycle threshold，Ct)，根據Ct值計算miR-551b的表達量。

1.2.2 臨床病理特征的收集 回顧膽囊癌患者的病史資料，收集以下臨床病理特征的信息：性別、年齡、術前CEA含量、術前CA19-9含量、TNM分期、腫瘤分化程度、微血管侵犯情況。術前CEA≥5 ng/ml為含量升高、CA19-9≥37 U/ml為含量升高，TNM分期參照美國癌癥聯合委員會(AJCC)的標準進行判斷，腫瘤分化、微血管侵犯參照術中所見及術后病理結果判斷。

1.2.3 生存期的隨訪 采用回顧門診復診資料以及電話回訪的方式進行生存期的隨訪，隨訪截止日期為2019-10，根據死亡時間計算患者的總生存期(overall survival，OS)。

1.2.4 miR-551b靶基因的生物信息學分析 在Targetscan網站中進行miR-551b靶基因的生物信息學分析，錄入miR-551b后分析miR-551b靶向的基因及位點。

1.2.5 miR-551b靶基因的western blot檢測 取膽管癌組織和正常膽管組織，加入RIPA裂解液后研磨組織，研磨液在4 ℃離心機中12 000 r/min,離心20 min，收集上清液并測定蛋白含量，取30 μg蛋白進行western blot檢測。將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中，電泳、電轉NC膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1 h，4 ℃孵育cyclinD1及β-actin的抗體過夜；次日，洗膜后室溫孵育二抗1 h，最后在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶，根據條帶灰度值計算表達量。

2 結 果

2.1 膽管癌組織和正常膽管組織中miR-551b表達量的比較 正常膽管組織和膽管癌組織中miR-551b的表達量分別為(0.78±0.22)和(0.48±0.15)，后者表達明顯減少，差異有統計學意義(t=9.115，P<0.05)。

2.2 不同臨床病理特征膽管癌組織中miR-551b表達量的比較 不同性別、年齡患者膽囊癌組織中miR-551b表達量的比較，差異無統計學意義；術前血清CA19-9升高、CEA升高、TNM Ⅲ期、低未分化、微血管侵犯患者膽囊癌組織中miR-551b的表達量明顯低于術前血清CA19-9正常、CEA正常，TNM Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、無微血管侵犯的患者，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 不同miR-551b表達患者總生存期的比較 與miR-551b高表達的膽管癌患者比較，miR-551b低表達的膽管癌患者的總生存期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

表1 膽管癌患者臨床、病理特征與癌組織中miR-551b的表達量分析

圖1 膽管癌患者miR-551b表達狀況總生存期比較

2.4 miR-551b靶向cyclinD1的生物信息學分析及臨床樣本驗證 在Target scan網站進行生物信息學分析，miR-551b靶向cyclinD1基因mRNA 3’UTR的第1456-1462堿基、1479-1486堿基，見圖2。進一步采用western blot檢測cyclinD1的表達量，蛋白條帶見圖3，正常膽管組織和膽管癌組織中cyclinD1的表達量分別為(0.55±0.21)和(0.87±0.28),膽管癌組織中cyclinD1的表達水平明顯高于正常膽管組織，差異有統計學意義(t=6.184、P<0.05)；膽管癌組織中cyclinD1的表達水平明顯高于正常膽管組織，差異有統計學意義(P<0.05)且cyclinD1的表達與miR-551b 的表達具有負相關關系(P<0.05，圖4)。

圖2 miR-551b靶向cyclinD1的生物信息學分析

圖3 膽管癌患者正常膽管組織和膽管癌組織中cyclinD1表達的western blot檢測

圖4 膽管癌患者癌組織中miR-551b與cyclinD1的相關性

2.5 膽管癌患者生存影響因素的Cox回歸模型分析 以膽管癌患者的預后作為應變量，以性別、年齡、術前血清CA19-9及CEA、TNM分期、分化程度、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表達作為自變量，經Cox回歸模型分析，術前CA19-9、TNM分期、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表達是預后的影響因素(P<0.05，表2)。

表2 膽管癌78例生存影響因素的Cox回歸模型分析

3 討 論

膽管癌的惡性程度高、早期診斷難度大，臨床上尚缺乏十分有效的治療手段，手術切除輔助以放化療的治療方式預后差、5年生存率低。膽管癌的發病機制仍未完全闡明，直接制約了靶向治療藥物的研發，因此，研究膽管癌的發病機制、尋找膽管癌發病過程中的關鍵調控基因是近些年相關領域的研究熱點[8-10]，探明促進膽管癌發生發展的關鍵基因不僅能夠為發病機制的研究提供理論支持，還有利于臨床工作中早期篩查疾病、準確判斷病情及預后。

miRs參與多種基因表達的調控，靶向抑癌基因的miR能夠起到促癌作用，靶向原癌基因的miR能夠起到抑癌作用。MiR-551b是具有抑癌作用的miR，在胃癌、結腸癌、宮頸上皮內瘤變中均呈低表達趨勢[11-13]。Wang等[4]關于miR-551b與膽管癌關系的研究證實，膽管癌組織及膽管癌細胞中miR-551b的表達減少，過表達miR-551b能夠抑制膽管癌細胞的增殖及細胞周期，同時也能抑制膽管癌移植瘤的生長。本實驗對膽管癌組織中miR-551b表達的分析結果與Wang等[4]研究結果一致。

癌細胞過度增殖是膽管癌重要的病理特征，本實驗進一步分析了miR-551b低表達與膽管癌臨床病理特征的關系，術前血清CA19-9及CEA升高、TNM分期增加、分化程度降低、微血管侵犯與膽管癌中miR-551b表達減少有關。CA19-9及CEA是消化道惡性腫瘤常用的標志物，雖然特異性較弱，但術前血清CA19-9及CEA的升高能夠在一定程度上反映腫瘤負荷的增加及病灶內癌細胞活躍的增殖；TNM分期增加、分化程度降低、微血管侵犯直接反映腫瘤病理特征惡化，提示癌細胞較強的惡性生物學行為。結合本研究的分析結果，膽管癌miR-551b的低表達與病理特征的惡化有關。

miR本身不直接參與細胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學行為的調控，其生物學作用的實現依賴于靶基因表達的調控，與靶基因mRNA 3’UTR結合后能夠使mRNA降解或阻礙mRNA反應，最終實現靶基因表達的負調控。Chang等[7]的細胞實驗證實，miR-551b能夠在膽管癌細胞中靶向抑制cyclinD1。本研究通過生物信息學分析驗證了這一靶向調控作用并發現：miR-551b靶向cyclinD1基因mRNA 3’UTR的第1456-1462堿基、1479-1486堿基。CyclinD1是調控細胞周期的關鍵蛋白，能夠加速細胞周期、促進細胞有絲分裂。國外Sittithumcharee等[14]及國內田立斌等[15]的研究均表明，cyclinD1的高表達參與膽管癌的發生發展。本研究的分析與前人的研究一致，即膽管癌中cyclinD1的表達量高于正常膽管組織。此外，本研究還證實了膽管癌中miR-551b與cyclinD1具有負相關關系，結合miR-551b靶向cyclinD1的生物信息學分析及他人的細胞實驗結果提示，靶向抑制cyclinD1是miR-551b參與膽管癌發生發展的可能機制。

本實驗還對膽管癌患者術后的生存情況進行了隨訪，經生存曲線分析可知：膽管癌中miR-551b低表達患者的總生存期較短，與miR-551b低表達和膽管癌病理特征惡化的分析結果吻合，進一步驗證了miR-551b參與膽管癌發生發展的結論。此外，本研究還在COX回歸模型中分析了膽管癌患者總生存期的影響因素，術前CA19-9、TNM分期、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表達被證實與膽管癌患者的遠期生存相關，由此也進一步明確miR-551b低表達在膽管癌發生發展中的作用。

綜上所述，膽管癌中miR-551b表達減少與病理特征惡化、總生存期縮短相關，靶向cyclinD1是miR-551b參與膽管癌發生發展的可能機制，今后miR-551b有望成為闡明膽管癌發病機制的候選基因，也可以將miR-551b作為靶點深入研究膽管癌的靶向治療方法。