納米探針應用研究進展及其對結腸癌診治的應用進展

劉志超，盧波君，楊 炯，屈亞威 綜述 劉海峰 審校

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一[1]，在國內，據調查其發病率呈逐年增高，每年新發病例約140萬例[2]。最新不完全統計數據顯示，至今美國2020年結直腸癌全年發病人數接近15萬人，占總癌癥發病人數的9%，死亡的9%，僅次于肺癌、前列腺癌、白血病，已成為癌癥中的第四大殺手[3]。

早期結腸癌手術后5年存活率可高達90%，而晚期存活率僅為17%[4]。因此，結腸癌的早期診斷與治療對于結腸癌的預后非常重要[5]。目前，纖維結腸鏡仍然是結腸癌早期診斷的金標準[6]，但受操作醫師技能的限制及結腸生理彎曲等因素，往往存在一定的漏診[7]。常規手術不能有效提高患者生存率[8]，而放射治療、化學藥物治療在殺死癌細胞時，會給人體正常細胞也帶來嚴重損傷，極大地降低了癌癥患者的生存質量[9]。納米探針技術在材料、生物、醫藥等領域的急速發展為我們更加精準、高效、低毒地診斷和治療癌癥提供了廣闊的思路。筆者綜述納米探針技術在結腸癌診斷和治療領域的研究進展，并展望其應用前景。

1 應用研究進展

納米探針是一種能探測單個活細胞的新型超微生物傳感器，具有體積小(1～100 nm)、能在細胞內實時測量、對細胞無損傷或微損傷等諸多特點，通過將藥物和成像試劑與納米探針有機結合，可以將藥物和成像劑精確地遞送到病變組織，達到有效治療癌癥、減少藥物毒副反應的目的[10,11]。自1960年全球首次報道脂質體作為蛋白和藥物載體以來，控釋聚合物、聚乙二醇化的脂質體、聚合物膠束、樹枝狀聚合物等眾多的納米材料被應用于疾病的診斷和治療[12]。

隨著研究的發展，發現無機納米材料，例如，量子點探針[13]、不同結構的納米金[14,15]、碳納米材料[16]、磁性納米顆粒、鈀納米片[17]、硫化銅納米材料[18]和其他新型納米材料[19,20],這些材料具有較高的對比度、穩定性和生物兼容性，可以實時動態成像，為癌癥的診斷和治療評價提供影像支持。前些年，無機探針在體內的潛在毒性與降解問題得不到有效的解決。近幾年，有機納米探針如有機近紅外染料[21]、卟啉脂質體[22]和高分子聚合物因在生物安全性方面具有明顯優勢而得到研究者們的廣泛關注，例如，NIR染料探針可隨尿液代謝出體外；基于蛋白質、脂質體、聚多巴胺等物質的光熱探針可在體內完全降解；聚苯胺、聚吡咯等光熱探針雖然不易降解，但也不會溶解并釋放出有毒元素[23]，因結構穩定性和光穩定性好而被用于光熱治療；部分聚合物材料具有良好的應用前景，但仍需要解決一些問題。

據不完全統計，截至2010年前已經有24種基于脂質體、聚合物、白蛋白和納米晶種材料開發的納米制劑被批準并應用于臨床。如：美國先靈葆雅公司生產Doxil/Caelyx(阿霉素-脂質體)可用于治療乳腺癌、卵巢和卡博西肉瘤 可用于治療乳腺癌、卵巢和卡博西肉瘤；美國阿斯利康公司制造并在2014年獲批上市的 Abraxane(紫杉醇-白蛋白混懸劑[24])成功用于治療晚期乳腺癌。納米探針不僅大大提高了抗癌藥物的腫瘤靶向作用，還顯著減少了傳統劑型中使用輔料以及高濃度下化療藥物本身所產生的毒副作用，多個地區及國家的臨床治療結果也顯示出其相比于傳統溶劑化療，探針包裹的腫瘤治療效果更好。

我國用于癌癥治療的創新的納米藥物在全國來說仍屬于產業空白，相比于美國日本等地起步較晚。江蘇恒瑞首仿的注射用紫杉醇(白蛋結合型)已獲得優先審評；國內的研究團隊在可降解聚合物納米膠束、脂質體包裹ICG 探針和DOX藥物復合納米顆粒制備上也已取得突破性進展，正在籌備審批用于臨床治療。利用納米探針技術精準及高效能地診斷和治療癌癥已成為可能，下一步研究的重點方向將是開發更加安全的納米級探針。

2 對結腸癌的診斷應用

傳統的生物醫學成像技術，如X線成像、超聲成像、核磁共振成像、計算機輔助層析等，對癌癥的早期檢測效果欠佳。目前，結腸鏡檢查是結腸癌診斷的主要方法，如白光內鏡、染色內鏡等，但單純直觀鏡檢難以在結腸癌早期靈敏、精準地診斷，而探針與鏡檢相結合可對人體內部生理或病理過程實現動態成像，從而對腫瘤進行更早、更有效地診斷[25]。

2.1 酶活化探針 酶的生物相容性強，表面的活性基團便于功能性修飾，因此，酶活化探針可以無創、實時、高特異性、高靈敏度地進行腫瘤病灶檢測。近年來人們發現某些近紅外光譜(NIR)染料與蛋白質之間存在共價或非共價相互作用[26]，從而探索以普通蛋白和酶負載NIR染料作為熒光探針來識別和定位結腸腫瘤細胞。Mitsunaga等[27]研究發現，γ-谷氨酰轉肽酶在結腸腫瘤細胞中高表達，可催化酶活化探針發出熒光，小動物活體實驗顯示，局部噴灑探針后5 min可探查到直徑<1 mm的結腸腫瘤病灶。余祖紅等[28]利用腫瘤的標志物基質金屬蛋白酶(MMPs)[29]特異性識別多肽底物的特性，設計和構建了分別將熒光素(FITC-N3)和熒光淬滅基團Dabcyl-NHS偶聯于多肽底物兩端，制備得到MMP-2/9特異性識別的熒光能量共振轉移(FRET)熒光分子探針Dab-GPLGVRGYFITC，將其成功應用于人源大腸癌細胞LoVo和臨床結腸癌組織樣本體外檢測初步研究，充分證明了探針對MMP-2/9檢測具有較強的特異性和靈敏度，檢測率高達95%以上。該探針與組織結腸癌裂解液作用后熒光信號比胃炎組織強5到9倍，因此對結腸癌早期臨床診斷具有極大潛力。

2.2 金納米探針 金納米(gold nanorods，GNRs)是將含金的金屬鹽合成球狀、棒狀及星形等多種形態、具有不同性質屬性的納米顆粒(直徑1～100 nm)。GNRs具有顯著的表面等離子共振(LSPR)特性、制備過程簡單、生物相容性和穩定性好，被廣泛應用于生物成像和治療中[30]。

Lin等[31]使用金納米顆粒作為表面增強拉曼光譜(SERS)[32,33]的探針，可動態地獲得結腸癌患者的血清生物化學信息。該方法的PCA-LDA(主成分分析-費希爾線性判別分析)診斷算法診斷結腸癌的敏感性和特異性分別為97.4%、100%，結果表明以金納米顆粒作為探針的表面增強拉曼光譜聯合PCA-LDA 對結腸癌的檢查具有極高的化學特異性、敏感性和分辨率，如果在今后的研究中，能夠克服掃描速度相對緩慢、光譜的信號較弱等限制因素，該方法會變得更加完善。

Huang等[34]利用Stober法將金納米棒表面的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)替換成硅殼層，顆粒表面修飾葉酸，合成了具有高效CT成像和光熱治療能力的多功能金納米診療體系(GNR-SiO2-FA)。金納米/銀納米的SERS以及局部表面等離子共振效應性質使其能夠高效地區分骨骼和其他組織，再結合光熱/光動力治療，易于實現金納米/銀納米的診療一體化[35]。

2.3 SERS免疫探針 席剛琴等[36]將制備的SERS探針與癌胚抗原(CEA，是唯一推薦用于結腸癌患者常規臨床檢測的分子標志物[37])單克隆抗體結合形成SERS免疫探針，將SERS探針與結腸癌組織切片上的相應的抗原發生特異性結合后進行SERS檢測和成像，結果顯示CEA在結腸癌腺上皮高表達，在間質及正常上皮基本不表達。該結果表明，SERS標記抗體檢測分析技術具有高敏感性和高特異性，有望應用于結腸癌組織切片中蛋白質表達的分析，成為結腸癌輔助診斷的一種重要方法。

2.4 抗原特異性結合探針 Sakuma等[38]研究中設計能與結腸癌組織TF(Thomsen-Friedenreich)抗原特異結合的探針，并將其局部應用到鼠原位結腸癌模型中，分別用白光內鏡及熒光內鏡成像，TF抗原在結腸癌組織中高表達，而在正常結腸組織中幾乎不表達，顯示出較好的特異性。結果顯示，熒光內鏡能發現傳統內鏡不易發現的病變，且可以檢測化療過程中TF表達的動態改變。

2.5 表皮生長因子受體特異性結合探針 Liu等[39]局部應用能特異結合EGFR(表皮生長因子受體)的熒光分子探針后，CLE局部成像，結果顯示，在37 例活體分子成像中，在結腸癌、結腸腺瘤患者檢測到熒光信號的比例分別為18/19、12/18，而在10 例正常黏膜處幾乎沒有或僅有很微弱的熒光信號。腫瘤組織的微循環以擴張、扭曲、囊性血管網的形成為特點，因此，對腫瘤血管的成像并確定其形態特征，是實現優化腫瘤靶向血管治療即抗血管生成療法目標的前提之一。

2.6 循環腫瘤細胞分子探針 腫瘤細胞突破細胞基底膜進入人體血液形成了循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)，是腫瘤逐步發展的重要標志，是腫瘤形成并轉移的早期狀況。與超聲、影像和穿刺等輔助檢查相比，外周血CTC檢測簡便、無創，能直觀、實時監測腫瘤進展。研制CTC分子探針是實現對實體瘤早期診斷的基礎[40]。國內龐代文團隊制備了EpCAM單抗修飾磁性納米粒子，實現了全血樣品中CTC的快速捕獲和檢測，已用于結腸癌除病理外的臨床檢測指導用藥中[41]。

2.7 上轉換納米粒子(UCNPs)探針 上轉換納米粒子(up-conversion nan-oparticles，UCNPs)具備抗光、發光穩定性良好，生物安全性高，易與抗體耦聯等的優點。曹永等[42]采用熱解法制備CD44v6功能化UCNPs探針，并將其用于體外結直腸癌腫瘤干細胞的熒光成像，為結直腸癌的早期診斷及治療提供實驗性理論基礎。

3 對結腸癌的治療應用

3.1 納米探針通過光動力療法治療 駱莉萍等[43]利用光敏劑誘導的光動力療法(PDT)[44]，評價血卟啉衍生物(HPD)和5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)兩種光敏劑對結直腸癌的治療效果，研究者們將120例晚期結直腸癌患者，隨機分成兩組，觀察組和對照組均采用常規化療，觀察組聯合PDT進行治療，周期3個月，結果，觀察組癥狀改善率、總有效率、中位生存時間均明顯高于對照組，并有統計學意義，從而證明用5-ALA生物誘導的光動力療法可有效緩解結腸癌患者的癥狀，延長生存期。

3.2 納米染色標記輔助內鏡下手術 據報道，結腸癌術后伴淋巴結轉移可能性高達45%以上，因此，傅駿等[45]探索向癌灶周圍注入鈉米碳染色標記，而后再行根治術，通過隨機對照發現，鈉米碳淋巴結示蹤劑染色效果良好，標記組淋巴結檢出數明顯高于對照組，轉移淋巴結檢出率和黑染淋巴結陽性轉移率均高于對照組。因此，能有效指導與定位結腸癌手術，正確制定手術方案并實施淋巴結清除術。

3.3 納米基因載體誘導結腸癌細胞凋亡 余麗[46]通過兩步接枝共聚法制備出粒徑較小、粒度分布均勻的RNA納米顆粒，選取人基因序列中的相關位點序列構建靶向的重組質粒，篩選出最佳的重組質粒載體，將新型殼聚糖聚乙二醇納米基因載體導入結腸癌細胞，評價納米基因載體對結腸癌的抑制和凋亡效果，結果顯示，殼聚糖聚乙二醇納米顆粒其細胞毒性低、轉染率高，能夠高效轉染結腸癌細胞株并有效干擾，誘導結腸癌細胞凋亡并抑制其增殖。其能長時間高效介導干擾沉默結腸癌細胞中的基因表達。

3.4 立體復合膠束對結腸癌的治療 沈可欣[47]成功應用納米技術合成制備聚乳酸立體復合膠束，并以環狀 RGD 多肽作為靶向配體基團修飾納米膠束，然后成功將化療藥阿霉素(DOX)裝載其中作為納米探針負載抗腫瘤藥物。最后驗證了納米膠束載體SCM/DOX及 cRGD-SCM/DOX能夠提高腫瘤細胞對藥物的攝取，確定了其在結腸癌治療中的靶向作用，達到殺傷消滅結腸癌細胞的效果。

綜上所述，現在國內已有不少優秀的科研團隊和企業在從事商品化納米探針的研發，并已初見成效，隨著納米技術在醫藥、生物、化學、材料、工程等多領域、多學科的迅猛發展，不同材料、不同結構整合于一體的多功能化納米顆粒將被制成探針，能夠研發出進一步降低生物毒性、增加穩定性和個體相容性的產業化納米探針。將來，納米探針技術會向集傳輸藥物、靶向跟蹤、分子影像學診斷、光熱治療、藥物控釋等功能于一體的方向發展，最終實現納米探針在腫瘤診療一體化領域的廣泛應用。