兒童非典型病原體肺炎病原及流行病學特征分析

王紫荊，方 劍，胡小林，侯曉華，謝屹峰，朱 靜，馬云馳，莊 琴

(成都兒童專科醫院內科一病區，四川 成都 610015)

肺炎是住院兒童中常見的疾病，對兒童的生長發育和身心健康影響較大，給家庭和社會帶來十分沉重的經濟負擔[1]。兒童肺炎可由多種呼吸道病原體感染引起，不同呼吸道病原體感染引起的肺炎臨床癥狀、體征相似，因此，臨床醫師僅僅依靠臨床癥狀、體征，很難對肺炎作出準確的病原學診斷[2]。如何早期確定兒童肺炎的病原體，對肺炎患兒進行精準的治療，一直是臨床醫師面臨的難題[3]。本研究采用多重逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)聯合毛細管電泳方法，對兒童肺炎常見13種呼吸道病原體進行多重核酸檢測，旨在了解成都地區兒童非典型病原體肺炎的病原構成和流行病學特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2019年3月至2020年2月成都兒童專科醫院收治的128例肺炎住院患兒，入選標準：①年齡≤14歲；②病程≤7天；(臨床癥狀體征及胸片檢查結果均符合肺炎診斷標準(參照全國高等學校教材供基礎、臨床、預防、口腔醫學類專業用《兒科學》第8版肺炎診斷標準)；④血常規+CRP檢測：WBC正常或降低、CRP正常或輕度增高(CRP≤30 mg/L)。排除標準：①年齡≤28天；②痰培養、PCT等檢查提示細菌感染者。128例患兒中男79例，女49例，年齡(4.49±3.25)歲；<1歲組16例，1～3歲組28例，3～6歲組51例，≥6歲組33例。

1.2 方法儀器和試劑：全自動核酸提取儀(由臺灣圓點奈米技術股份有限公司生產，型號：Smart Lab Assistant SLA-32)、全自動基因擴增儀(由北京東勝創新生物科技有限公司生產，型號：ETC 811)、3500DX基因分析儀(由賽默飛世爾科技公司生產，型號：3500DX)、13項呼吸道病原體多重檢測試劑盒(由寧波海爾施基因科技有限公司生產)。咽拭子標本的處置：將加有保存液的咽拭子標本置于渦旋混勻儀上充分渦旋10秒鐘，以洗下咽拭子標本上粘附的病原及含有病原的細胞。核酸提取：使用“核酸提取或純化試劑”(備案號：浙溫械備20150246號)在自動化提取工作站Smart LabAssist-16/32(備案號：國械備20140202)上進行自動核酸提取。或者使用“核酸提取或純化試劑”(備案號：浙溫械備20150006號)進行手動核酸提取。吸取相應體積的樣本(包括陽性對照和陰性對照)并加入2 μl的RT-PCR內參共同提取。RT-PCR多重擴增和毛細電泳分離檢測：在同一個PCR反應體系中構建多對引物，不同引物可與不同呼吸道病原的目的基因特異性結合。首先通過對13種呼吸道病原體的檢測靶點和3個內參靶點進行特異性的逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)多重擴增，再采用毛細管電泳技術對擴增產物進行分離和檢測，從而得到相應病原體的檢測結果。收集患兒的臨床資料，并記錄咽拭子多重核酸檢測結果。在患兒入院當天采集咽拭子，采用多重逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)聯合毛細管電泳方法，檢測13種呼吸道非典型病原體的核酸(RNA類：甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠狀病毒；DNA類：腺病毒、博卡病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體)。

1.3 統計學方法應用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理和分析。各年齡組患兒病原檢出陽性率和多病原混合感染檢出率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病原檢出情況在128例標本中，檢出至少1種病原的有78例，檢出陽性率60.94%。各年齡階段患兒病原檢出陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=3.51，P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡組肺炎患兒病原檢出陽性率比較

2.2 病原季節分布趨勢甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒存在季節流行特征，以冬春季節多見，其它病原無明顯季節性。

2.3 不同種類病原檢出情況128例患兒中，不同種類病原檢出率見圖1，其中檢出率居于前3位的病原依次是：肺炎支原體、鼻病毒、甲型流感病毒，偏肺病毒、博卡病毒、冠狀病毒檢出率最低。各年齡組患兒中，不同病原檢出率見表2。

圖1 不同種類病原檢出率

表2 不同年齡組患兒病原檢出率 [n(%)]

2.4 多病原檢出情況在128例標本中，同時檢出2種病原的有19例，混合感染檢出率14.84%。在各年齡階段患兒中，同時檢出2種病原檢出率比較見表3。在不同年齡組之間，混合感染檢出率比較差異有統計學意義(χ2= 14.51，P< 0.05)，其中1～3歲組混合感染檢出率最高。沒有發現超過兩種病原混合感染的病例。

表3 不同年齡階段患兒中同時檢出2種病原檢出率比較

3 討論

在兒童非典型病原體肺炎中，多種病原體混合感染的現象日益增多，目前傳統的病原學檢查方法包括：病原分離和培養、免疫學、分子生物學等檢測方法。雖然病原的分離和培養是病原檢測最可靠的方法[4]，但是其培養條件要求苛刻、技術要求高、靈敏度低、耗時較長，不適合用于臨床早期診斷；免疫學法雖然是臨床常見的病原檢測方法，且操作簡單、快速，但易受患兒的病程、年齡等因素影響較大[5]，特異度和靈敏度低，可出現假陰性，臨床應用受限；常規PCR法雖然具有快速、敏感度和特異度高，但檢測通量低，每次只能檢測一種病原體，可能會錯過和延遲對復合感染的診斷和治療。故呼吸道病原多重核酸檢測技術就應運而生[6，7]，它是以普通PCR檢測方法為基礎，進一步發展演變而來的，可同時檢測多種病原體，不僅技術簡單、快速、準確、高效，還可以提高樣本的使用效率[8～10]。

本組患兒結果顯示，兒童肺炎非典型病原體檢出陽性率較高，其中以肺炎支原體、鼻病毒、甲型流感病毒最為常見。在各年齡組患兒中，檢出率高的病原種類有所差異：在<1歲組患兒中，鼻病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒檢出率較高，其中呼吸道合胞病毒感染多見于1歲以下患兒；在1～3歲組患兒中，鼻病毒、甲型流感病毒、副流感病毒檢出率較高；在3～6歲組患兒中，肺炎支原體、鼻病毒、甲型流感病毒(或腺病毒)檢出率較高，其中支原體感染多見于3歲以上患兒；在≥6歲組患兒中，肺炎支原體、肺炎衣原體、鼻病毒(腺病毒或乙型流感病毒)檢出率較高。甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒具有明顯季節流行特征，以冬春季多見。

在兒童肺炎中，多種病原混合感染現象比較常見，以1～3歲組患兒混合感染檢出率最高。沒有發現超過兩種以上病原體混合感染的病例出現，估計與本研究納入患兒的病情不是太嚴重有關。