牙齦卟啉單胞菌菌毛與消化道腫瘤關系研究

鄭月月，李智濤，韓海芳，梁夢歌，高社干

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是口腔內數百種細菌之一，是一種高度厭氧的革蘭氏陰性菌，與牙周病密切相關[1]。牙周病(periodontal disease,PD)是牙周組織的慢性疾病，包括牙齦炎和牙周炎。牙齦炎是牙齒周圍軟組織中最初的可逆性炎癥病變，牙周炎是導致牙周組織破壞的多種因素共同作用結果，會導致不可逆骨吸收和牙齒脫落[2]。該細菌除引起口腔感染外，在冠心病、中風和糖尿病的發生中發揮作用[3]。

牙菌斑是牙齒表面的一種生物膜，在口腔中具有高度組織和整合微生物群落的功能。牙齦卟啉單胞菌是牙菌斑組成的一部分，使牙菌斑具有一整套重要毒性特征。牙齦卟啉單胞菌中含有大量致病因子，包括菌毛、半胱氨酸蛋白酶、血凝素和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，這些因子與宿主免疫系統的許多相互作用強烈支持了牙齦卟啉單胞菌作為病原體的毒力。其中，菌毛是牙齦下菌群定植的關鍵因素，因為菌毛能促進細菌對靶點的黏附和侵襲[4]。

近年來，越來越多的研究集中到Pg對相關腫瘤發生發展的影響上，隨著研究深入，發現菌毛蛋白在與宿主相互作用和定植、逃避免疫防御、牙周組織破壞等方面發揮重要作用[5-6]，這能解釋Pg是如何影響消化道腫瘤的。本文對Pg菌毛致病機制、免疫系統以及Pg與相關消化道腫瘤的關系進行綜述。

1 牙齦菌毛致病機制及作用

1.1 菌毛

菌毛是位于細菌表面的絲狀結構，可增強細菌與多種表面的黏附，如細胞基質、宿主細胞和其他細菌，并參與生物膜形成。菌毛是從細菌細胞外膜伸出3～25 μm、薄的、蛋白質表面附屬物，這些結構藏匿在牙齦弧菌菌株中[7]。牙齦卟啉單胞菌在細胞表面有兩種不同菌毛：一種是由菌毛基因(稱為長菌毛或主菌毛)編碼亞單位蛋白(稱為菌毛或菌毛蛋白)組成；另外一種是由mfa1基因編碼的亞單位Mfa蛋白組成，稱為短菌毛、小菌毛或Mfa菌毛[8]。它們都調節細菌對各種分子和口腔基質的依賴性，對生物膜形成起重要作用。Hajieshengallis等[9]根據氨基酸和DNA序列，把fimA分為6種類型：fimAⅠ-fimAⅤ和Ⅰb型。Ikai等[10]報道成熟菌毛具有Mfa1蛋白，還含有Mfa2-5蛋白。Mfa2起錨定的作用，Mfa3與Mfa1、Mfa2、Mfa4、Mfa5在體外結合，作為結合蛋白與其他菌毛亞單位連接起來。Hall等[11]研究表明，Mfa1的C-末端結構域，影響下游菌毛蛋白的聚集和成熟。

1.2 短菌毛

Pg的Mfa1菌毛參與黏附，與口腔生物膜中的協同物種結合。Mfa1菌毛由5種蛋白質組成：構成菌毛頂端復合體結構成分的Mfa1、錨定Mfa2、Mfa3、Mfa4、Mfa5[12]。Mfa1的聚合與Mfa3-5無關，需要RgpA/B介導的蛋白水解過程。Mfa1的N-端和C-端都是聚合所需要的，而這些區域中潛在的破壞氨基酸取代的β鏈不損害Mfa1聚合[13]。恰恰相反，用N-端或C-端結構域中的帶電殘基替換疏水性氨基酸產生未能聚合的Mfa1蛋白[14]。Mfa3是Mfa1和其他輔助菌毛蛋白之間的銜接蛋白，Mfa1菌毛聚合依賴于N-末端和C-末端區域疏水性[10]。Hospental等[15]研究發現，在大腸桿菌的Ⅰ型和P型菌毛系統中，菌毛蛋白是缺乏β鏈的C末端保守不完全IgG折疊，該折疊形成一個疏水槽，與另外一個亞基上N-末端β鏈相互作用，從而形成二聚結構，兩個末端之間相互作用產生菌毛結構的聚合主鏈。

Mfa1菌毛與人樹突狀細胞的DC-SIGN受體結合[14]。Zeituni等[16]報道Mfa1和DC-SIGN相互作用，有助于Pg進入樹突狀細胞，使Pg在樹突狀細胞內持續存在，導致樹突狀細胞成熟受阻，并刺激Th2效應反應，從而使炎癥細胞因子水平降低。Hasegawa等[17]發現，mfa1、mfa2、mfa3、mfa4排列在一個操縱子中，mfa5是獨立轉錄的。Mfa2位于菌毛的基部，起著錨定、修飾和伸長終止作用。Hasegawa等[18]報道，Mfa3定位于Mfa1菌毛末端部分，作為與宿主細胞和其他口腔細菌受體的配體而發揮作用。Shoji等[19]發現Mfa1、Mfa3和Mfa4通過信號肽酶Ⅱ的表達發生，被脂蛋白運輸到細胞表面，在細胞表面被Rgp切割而產生成熟形式。Hasegawa等[14]報道，Mfa5含有血管性血友病因子a型結構域，通過Ⅸ型分泌系統(T9SS)轉送到細胞表面。

1.3 長菌毛的其他成分

通過對PgfimA基因側翼區域和典型模型檢測的綜合分析。下游ORF(open reading frame,ORF)，即ORF1、2、3、4，分別編碼15、50、80和19 KDa蛋白，在每一種蛋白對應特異性抗體中，有兩種針對50和80 kDa產物的抗體與純化菌毛反應，被認為是與菌毛相關的次要成分。最近有報道3種ORF(FimC、FimD、FimE,分別命名為ORF2、3、4)編碼與FimA蛋白相關的小組分[20]。FimC和FimD被認為是在FimA纖維上組裝所必需的，而FimA上游的兩個基因參與FimA表達的調控。此外，FimA的表達受FimA蛋白本身表達水平以及Rgp和Kgp的控制。有報道稱，FimC、FimD和FimE突變體失去自身聚集能力，從突變體中純化的長菌毛與口腔鏈球菌GAPDH以及纖維粘連蛋白和Ⅰ型膠原的結合率降低[17]。因此，FimC、FimD和FimE可能是與長菌毛相關的黏附性末端成分，而重組FimA蛋白表達各種結合活性，同時它被稱為黏附分子。純化的FimC和FimD與CXCR4相互作用，FimC和FimD與纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原結合，FimE不能與這些基質蛋白相互作用。這些研究結果表明，FimC、FimD、FimE在Pg的毒力和組裝菌毛功能中起重要作用[21]。

1.4 fimA基因分型的致病機制

FimA由fimA基因編碼，在Pg的染色體上以單拷貝形式出現[22]。中川等[23]證明與fimA基因Ⅱ型相對應的重組FimA蛋白比其他基因型FimA蛋白在動物模型中具有更強的黏附和侵襲人類上皮細胞的能力。對fimA各種基因型致病性進行實驗，fimA基因型Ⅱ、Ⅰb和Ⅳ比fimA基因型Ⅰ和Ⅲ的菌株表現出更強的感染癥狀和炎癥變化。另外，fimAⅠ型基因被Ⅱ型基因代替的突變體表現出較強的細菌黏附和侵襲能力。與此相反，用fimA基因Ⅰ型替換Ⅱ型導致侵襲黏附能力下降，Ⅱ型菌毛是毒力的關鍵決定因素。在慢性牙周炎中，fimAⅡ、fimAⅣ、fimAⅠb這3種基因型的Pg分離株比其他基因型的分離株更為普遍。有研究表明，fimAⅡ型基因在牙周炎和類風濕性關節炎患者中檢出率較高，不同fimA基因型對牙周炎患者侵襲性致病潛力，Ⅱ型菌株更加普遍[24]。在健康成人中，fimA基因型Ⅰ的分離物在牙齦桿菌陽性中較為普遍，其次是Ⅴ型。從牙周炎患者口腔中采集的Pg株,經過臨床培養的菌株fimA基因分型，基因型Ⅱ型、Ⅳ型和Ⅰb型與毒力有關[25]。

在運用PCR檢測技術對fimA基因分型研究中，發現幾種不同引物的PCR交叉反應呈現陽性。Enersen等[20]為了解釋幾種fimA引物PCR檢測結果多重陽性反應菌株，用新的引物對選定的一些菌株進行測序，主要關注多重PCR反應陽性的菌株，證實fimA基因保守，在被檢測的菌株中只有微小變異。除fimA基因變異外，其他特性可能與黏附和侵襲能力有關。這種結論得到了Inaba等[21]支持，他們報告了fimAⅡ型菌株的異源毒力，表明致病潛力和侵襲效率與細胞外分泌牙齦蛋白有關。大量實驗和臨床研究表明，fimA基因型可能是Pg致病力的決定性因素[26]。

1.5 菌毛在生物膜形成中的作用

生物膜的形成是一個復雜過程，涉及可逆性和不可逆性的細菌黏附、菌落形成、穩定三維結構形成和分散[27]。早期細菌的定植者，包括鏈球菌，附著在口腔表面，如唾液膜覆蓋在牙齒表面。后來定植者附著在先前有機體上并組裝成生物膜，是通過與其他細菌物種的共黏附介導的。長菌毛與細菌的細胞壁有很長的距離，表明它們是首先與其他細菌以及宿主細胞相互作用的細菌成分[8]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是一種典型的糖酵解蛋白，參與供能，被認為是一種真核細胞和真菌保守的多功能管家蛋白。長菌毛和GAPDH之間的相互作用是鏈球菌表面Pg與牙齦假絲酵母菌的最初接觸[28]，介導鏈球菌黏附的亞單位蛋白fimA的結合域定位于C末端區域。人類GAPDH也被證明與Pg長菌毛結合。

有報道稱，短菌毛通過與鏈球菌SspA和SspB表面蛋白(抗原Ⅰ/Ⅱ家族)的黏附素受體相互作用介導與Pg之間的共黏附。SspA和B與短菌毛結合，比GAPDH與長菌毛結合親和力高，從而提高短菌毛結合的親和力[29]。長菌毛和短菌毛在生物膜形成中的作用不相同。利用缺陷突變體研究一組菌毛和牙齦蛋白(Rgp和Kgp)對同型生物膜形成的影響，結果表明，長菌毛促進生物膜的初始形成，進一步對生物膜的成熟起到抑制作用[30]。然而，短菌毛和Kgp對生物膜的發育具有抑制和調節作用[31]。另外，Rgp可能控制微生物菌落形態和生物量。有報道稱，中間鏈球菌分泌的精氨酸脫氨酶可抑制fimA和mfa1的表達，同時也說明，這種精氨酸脫氨酶可以導致Pg生物膜的形成，因為Pg的自聚作用歸因于FimA蛋白[32]。

1.6 長菌毛介導的免疫破壞

TLR信號通路與補體系統串擾，現在補體系統被認為在病原體標記和消除之外發揮作用。最近研究表明，Pg通過降低細胞免疫激活因子干擾素(IFN-γ)的水平來抑制細胞免疫[33]。Pg長菌毛與CR3相互作用，激活細胞外信號調節激酶1/2信號，抑制TLR2信號介導的IL-12生成[34]。另外，Pg的純化菌毛與CR3的相互作用抑制放線菌等其他細菌LPS誘導小鼠巨噬細胞或人單核細胞產生IL-2和IFN-γ的能力。IL-2可調節IFN-γ的產生，也是參與病原體清除的關鍵細胞因子，IFN-γ是巨噬細胞殺菌活性的有效激活劑。所以，CR3激活與TLR-2途徑和IL-12的抑制相互作用，促進了Pg在體內外的生存。長菌毛與TLR2相關受體CXCR4相互作用，抑制人單核細胞和小鼠巨噬細胞TLR2激活。另外，長菌毛誘導CXCR4介導的cAMP依賴性蛋白激酶A的激活，抑制TLR2誘導的NF-κB對Pg的激活。這些研究結果表明，長菌毛能使Pg在體內外具有抗清除能力。此外，OMZ314菌株的Ⅱ型菌毛能顯著誘導細胞因子表達，盡管還沒有明確發現，然而，不同類型的菌毛可能引起免疫破壞潛能不同。

2 Pg在消化道腫瘤中的作用機制

2.1 Pg與腫瘤發生的機制

Ahn等[35]的一項研究首次闡明消化道腫瘤死亡率與Pg的相關性，Pg在消化道腫瘤中可以作為一種有價值的微生物標志物。Pg除誘導腫瘤細胞侵襲和激活TLR(Toll樣受體)外，還發現其他可能機制[36]。首先，Pg分泌的核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase,NDK)具有促進腫瘤發生作用。NDK抑制嘌呤能受體(purinergic receptor)的ATP激活，從而抑制上皮細胞IL-1β產生。IL-1β在誘導IFN-γ產生腫瘤抗原特異性CD8+T細胞中起重要作用，Pg分泌的NDK也能使腫瘤逃避免疫監視。NDK介導的ATP降解也抑制了依賴于P2X7受體ATP激活的細胞凋亡。此外，NDK對Pg熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)的磷酸化作用使牙齦上皮細胞具有抗凋亡表型，提示HSP27是抑制Pg致宿主細胞凋亡的關鍵分子。其次，Yilmaz等[38]注意到抑制上皮細胞凋亡是Pg的一個重要致癌作用，也是癌細胞的一個內在保護機制。激活JAk1/AKT/STAT3信號，增加Bcl2(抗凋亡)/Bax(促凋亡)比率，減少釋放促凋亡因子細胞色素c，阻斷caspase-9和caspase-3的激活都可以參與這一過程。另外，Pg調節microRNAs(miRNAs)的表達水平，由于Pg引起的miR-203的上調引起細胞因子信號抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)水平降低，進而抑制上皮細胞凋亡。由于SOCS3能與磷酸化JAK(janus kinase)受體結合，因此SOCS抑制JAK/STAT3信號。第三，Pg誘導B7-H1受體表達，該受體屬于B7家族，在免疫反應中起著重要調節作用。另外，B7-H1受體介導的共刺激信號可引起活化的T細胞無能和凋亡，從而使腫瘤逃避免疫應答。第四，Pg引起的癌變也有助于誘導致癌物的代謝。例如，Pg將乙醇脫氫成乙醛，乙醛是一種致癌物的衍生物，能引起DNA損傷、上皮細胞突變和過度增殖[35]。慢性炎癥與腫瘤的發生發展有密切的關系，炎癥因子如IL-6的釋放可以通過引起DNA低甲基化和啟動子區高甲基化的異常變化來促進腫瘤的發生[37]。

2.2 Pg與口腔癌的關系

口腔由牙齦、舌背、舌側、口腔黏膜等不同界面組成，這些組成有助于各種微生物定植和生長。2016年，全球口腔癌新發48，330例，死亡9，570例，被認為是全球第六大常見腫瘤[43]。在口腔癌中最常見的是口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)。Katz等[38]發現癌細胞中Pg的濃度高于口腔正常組織，認為Pg可導致口腔癌并成為上皮細胞轉化為腫瘤的誘因。當Pg感染患病率為40.7%，Pg感染者與未感染者相比會使腫瘤和牙周病的發生率增加1.36倍。Kang等[39]的研究表明，頭頸部腫瘤患者和健康成人的Pg感染率存在顯著差異。此外，與未感染Pg的對照組相比，長期Pg感染組中細胞的CD44和CD133表達上調，這兩種腫瘤干細胞標志物具有明顯致瘤性。通過激活ERK1/2-ETS1、p38/HSP27和PAR2/NF-κB，Pg增加了基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9, MMP-9)水平，從而促進OSCC細胞系的侵襲性。與Pg未感染細胞相比，感染Pg的細胞MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-10的表達水平呈時間依賴性增加[40]。另外，活化的MMP-9已被證實能增加腫瘤細胞侵襲性。Ha等[41]研究表明，Pg通過上調IL-8和MMPs(特別是MMP-1和MMP-2)促進OSCC細胞的侵襲。Geng等[42]通過建立Pg攻擊口腔上皮細胞23周的實驗模型，發現長期接觸Pg可加速細胞周期，促進細胞遷移和侵襲能力，在其他器官轉移和增殖。與未感染Pg相比，慢性感染可通過血液途徑促進體內轉移。

2.3 Pg與食管癌的關系

在全球范圍內，食管癌發病率居第八位，也是致死率第六位的腫瘤，我國中部是高發區[43]。食管癌早期診斷比較困難、發展迅速，死亡率比較高。這種腫瘤主要有兩種組織學亞型：鱗狀細胞癌和腺癌，鱗狀細胞癌在發展中國家很常見，腺癌在發達國家比較常見[44]。通過檢測ESCC患者Pg抗原和牙齦蛋白酶的表達強度，以及檢測Pg特異性16SrDNA，均明顯高于周圍組織和正常對照組[37]。此外，腫瘤細胞的分化、ESCC(食管鱗狀細胞癌)的遠處轉移、ESCC患者生存率等臨床病理因素均與Pg呈正相關。表明Pg感染可能是ESCC的一個危險因素，而且還可以作為ESCC的預后指標。Pg抑制上皮細胞凋亡、促進腫瘤細胞免疫侵襲和誘導潛在致癌物質的代謝，都是ESCC發生發展重要因素。Gao等[45]首次報道宿主對Pg的免疫反應與ESCC細胞惡性增殖的關系，提示抗Pg抗體IgG和IgA可能作為ESCC的血清標志物，兩者結合可以提高診斷率和改善預后。有報道稱，食管癌的Pg感染率遠高于賁門癌，而胃癌感染率幾乎為零，這是由于缺乏酸適應[9]。

2.4 Pg與胰腺癌的關系

胰腺癌發病率較低，2007年至2013年的研究發現各期5 a生存率僅為8.2%。導致胰腺癌預后不佳的因素有很多，例如患者自身長期化療抵抗力下降、缺乏診斷和預后的血清生物標志、缺乏個體化治療的生物標志等[46]。多項研究表明，口腔微生物群和消化道微生物群之間存在重疊，部分原因是咀嚼和口腔衛生，如刷牙和使用牙線，這促進了多種傳播途徑失調。另外，口腔健康不良與胰腺癌發病率增加有關[47]。口腔微生物引起牙周炎的患者，胰腺癌的發生率比較高。一個歐洲研究團隊發現，Pg ATCC 53978株血清抗體升高可使胰腺癌風險增加3倍[46]。最近研究表明，Pg啟動了Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)信號通路，在動物模型中TLR的激活對胰腺癌的發生起著關鍵作用[34]。這被認為是Pg增加胰腺癌發生率的直接證據。另外，在胰腺癌患者中檢測到高發的腫瘤抑制基因p53突變，說明p53基因異常是人類胰腺腫瘤發生的一個重要因素[48]。總之，Pg被認為是胰腺癌發生發展的生物標志，闡明Pg對胰腺癌的作用機制，加強實驗研究，有望遏制胰腺癌高死亡率，緩解胰腺癌的現狀。

2.5 Pg與結腸癌關系

口腔和結腸雖然解剖上距離遠，但都是由不同微生物群高密度定植。研究表明，口腔細菌能傳播到結腸。這在牙周炎等疾病中最為明顯，在牙周炎中，Pg和具核梭桿菌表現出致病性[49]。在結腸中，這些細菌可以在復雜的生物膜環境中改變微生物群組成，導致腸道失調。這種破壞促進了免疫的異常和炎癥反應，最終導致結直腸癌(colorectal cancer,CRC)腫瘤的發生。了解Pg與結腸癌之間相互作用的確切機制，有助于結腸癌預防和治療。

雖然細菌從口腔轉移到結腸的詳細機制尚不清楚，但已經發現了兩種可能的途徑。第一個傳播途徑是通過連續吞咽。在慢性牙周炎中，口腔Pg和腸道微生物群通過幾種機制保持相對獨立，包括十二指腸中的膽汁酸和胃酸[50]。能夠抵抗惡劣的胃酸性環境的口腔細菌可以通過這一途徑維持其生存能力。這是Pg的一個特殊特征，因此有助于其遷移到結腸，從而改變結腸微生物群的組成和功能[51]。一個可能的因素是吞咽死亡的細菌成分，這些成分會上調細菌毒性因子的表達并誘發細胞毒性，這一概念被稱為“營養性壞死毒性”。在一項體外研究中，至少10∶1的死菌與活菌比與牙周病原菌的感染顯著相關，尤其是Pg[52]。與毒力因子相關的基因表達上調，包括牙齦蛋白酶基因rgpA、rgpB、kgp和菌毛fimA基因，也反映了上述效應。第二種傳播途徑是通過血液和全身循環(菌血癥)傳播到口腔外部位，包括關節、心臟和結腸。Pg和具核梭桿菌能夠通過潰爛的牙齦袋侵入血流。Pg也可以在免疫細胞內生存，包括樹突狀細胞或巨噬細胞，隨后傳播到身體各部位。

Pg從口腔進入結腸后，能夠降解結腸中的黏蛋白和細胞外基質，導致黏液層浸潤并通過破壞上皮連接侵入黏膜。受干擾的黏膜生態系統促進蛋白水解病原體Pg的過度生長。例如，Pg產生半胱氨酸蛋白酶，稱為“牙齦蛋白酶”(Kgp和Rgp)，對賴氨酸或精氨酸都有特異性，這些蛋白酶參與細菌生物膜的形成，隨后刺激血管通透性和組織損傷[53]。此外，牙齦蛋白酶能夠降解免疫因子，從而觸發其生存的抗菌免疫反應。口腔細菌不斷破壞結腸中的宿主蛋白質，導致慢性炎癥狀態，持續為微生物菌群產生營養物質，并促進結直腸癌的發生[54]。

口腔細菌的結腸生物膜可以通過合成致癌代謝物多胺進一步損害結腸。多胺是生物膜形成和微生物群存在的強制性因素，可誘導腫瘤異常增殖[55]。Pg在口腔中產生大量硫化氫(H2S)，H2S具有遺傳毒性，可導致基因組不穩定或聚集的DNA突變劑。大量H2S生成酶在大腸癌中的表達上調，如胱硫醚-β-合成酶，它促進H2S的過度生成，進而通過誘導遷移、侵襲和增殖的內吞途徑和刺激腫瘤血管生成而影響結腸癌的發展和擴散[56]。

本文主要對Pg毒力因子菌毛、Pg與消化系統腫瘤之間的致病機制進行討論。Pg的fimA不同分型對人致病性存在一定差異，在健康人和牙周疾病患者中主要以fimAⅡ型檢出率較高。fimAⅣ型在慢性牙周炎中的檢測高于其他幾型，其被認為是高致病性菌株，短菌毛的致病機制尚不清楚，有待進一步研究。Pg能使上皮細胞脫落和蛋白水解，Pg蛋白水解能力強，促進免疫反應，為生物膜形成創造了營養基礎，同時抑制補體免疫等防御機制。Pg釋放一些代謝物質會刺激牙周炎疾病發生。Pg能夠合成各種致癌物質，如H2S等。消化系統腫瘤與Pg毒力因子之間是否有特異性機制，有待研究。總之，尚需要更多的研究來確定Pg與消化道腫瘤之間的關系。清除口腔Pg，降低Pg的感染率能否降低相關腫瘤的發病率是另一個富有挑戰性的課題。