食管癌預后的生物標志物研究進展

閆錦陽，米優嘉，李婉瑩，阮豪杰，耿聰聰，高社干

食管癌(esophageal cancer，EC)是全世界最常見的消化道惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有惡性腫瘤的第六位。2015年中國食管癌發病人數預計為47.79萬人，同年有37.5萬人死亡[1]。EC常見有鱗癌和腺癌兩種亞型，西方主要常見腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)，而我國則以鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為主[2]。從輕度不典型增生至重度不典型增生，再至原位癌，最后成為侵襲性腫瘤，EC的發生是多種因素參與形成的復雜結果。盡管提倡早發現、早切除和多手段綜合治療，但大多數患者仍會經歷較長時間的無癥狀期和診斷困難的早期階段，往往確診時已發展至中晚期，導致出現高死亡率，伴隨生活質量低下。目前基于常規病理變量，如腫瘤大小、分級和腫瘤分期，預測EC患者預后主要憑借醫師豐富的臨床經驗[3]，且受到一定個體異質性的影響，故需要引用更加客觀的指標幫助評估及管理患者[4]。一些生物標記物(液體活檢、基因組學分子和蛋白質組學分子)可以較容易從組織和/或體液中分離出來，具有一定的臨床應用價值[5]。以下回顧最新的研究進展進行綜述。

1 與腫瘤增殖生長相關指標

細胞異常增殖是惡性腫瘤的典型特征。一些生物分子信號導致正常食管上皮細胞在分裂過程中發生異常，在腫瘤細胞增殖過程中扮演著重要角色。這些表達異常的分子和患者的預后緊密相連，有可能成為EC患者潛在的預后標志物。

Tang等[6]發現定位于11p15.5人染色體上的基質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)是內質網膜上的Ca2+感應蛋白，表達水平與食管癌晚期分級呈正相關，刺激腫瘤細胞增殖生長，有助于幫助預后判斷。有報道稱沉默厚體1(dickkopf-1，DKK1)作為一種致癌基因，其分泌蛋白可通過與細胞表面Ⅱ型跨膜蛋白CKAP4結合激活PI3K-AKT通路，從而促進ESCC細胞增殖[7]。另外，富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11，PRR11)的過度表達提高腫瘤細胞的成瘤能力，其預后往往不佳[8]。相反，大腦表達X-連鎖基因1(the brain expressed x-linked gene 1，BEX1)的啟動子出現高度甲基化調節基因轉錄，其表達量明顯與腫瘤體積大小相關，可作為腫瘤潛在抑制因子來預測患者的生存期[9]。

非編碼RNA指不具有翻譯蛋白質功能的RNA分子，包括Endo-siRNA、MicroRNAs、Piwi-interacting RNAs、Long noncoding RNAs、CircularRNAs等。MicroRNAs是一種長度含有18～25個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，通過抑制或者降解靶基因的表達起到調控作用，是參與細胞發育、維護內環境穩態的關鍵調控因子，不少研究認為MiRNA失調參與許多惡性腫瘤發生發展。Liu等[10]發現MiR-93-5p可通過外泌體進入腫瘤細胞，作用于PTEN基因，促進下游蛋白P21和Cyclin D1的過表達，導致受體細胞過度增殖。低表達的MiR-574-3p與食管癌患者腫瘤大小、淋巴結侵襲和預后密切相關，通過靶向作用于FAM3C和MAPK1蛋白調節PI3K/AKT及RAF/MEK/ERK兩大信號轉導通路，從而促進細胞凋亡，抑制移植腫瘤細胞生長[11]。過表達MiR-384通過抑制靶基因LIMK1，既阻斷腫瘤細胞進入增殖活躍S期，又促進細胞發生凋亡，體外實驗再次證明上調MiR-384可減緩腫瘤及淋巴結的生長速度和體積[12]。

長鏈非編碼(long noncoding RNAs)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，它們多在轉錄后發揮抑癌或促癌作用。目前公認P53是第一個被發現與腫瘤相關性最高的抑癌基因，不僅誘導細胞發生凋亡,還對細胞生長產生抑制效應[13]。沉默LncRNA AK001796可誘導細胞周期停滯在G0/G1期，進一步實驗表明，LncRNA AK001796通過調節MDM2/P53信號通路促進腫瘤細胞增殖，可作為預后不良因素之一[14]。LncRNA 01617[15]、LncRNA CASC11均被發現在EC中高表達，加快細胞惡性增殖，促進腫瘤發生，且表達情況與患者預后緊密相關[16]。

2 與腫瘤浸潤轉移相關生物學指標

EC轉移包含淋巴結轉移、遠處轉移等，是醫師及患者著重關注的疾病發展節點，預后結局往往不佳。因此需要尋找相關分子標志物對患者病情進行早期診斷和預后評估，進而輔助臨床治療，幫助受益。

在腫瘤轉移進展過程中，上皮—間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一個重要現象。上皮細胞失去細胞極性、失去與基底膜連接等上皮表型特征，獲得間質表型，可導致遷移能力和侵襲性增強，加速腫瘤轉移過程。EMT轉變過程中重要的核心調控因子包含Snail、Zeb1、Twist等等，其中，正常細胞內Snail翻譯水平受到泛素化修飾并被核蛋白酶降解[17]。而去泛素化酶OTUB1[18]、PSMD14[19]均可介導Snail去泛素化過程維持其蛋白質結構及功能穩定從而誘導EMT過程，促進EC腫瘤轉移。此外，YAP(yes-associated protein)、CD44v9(CD44 variant 9)、IBSP(integrin binding sialoprotein)、 TCF21(transcription factor 21)也參與 EMT過程，起到正向或負向調控作用[20-23]。

Luo等[24]研究發現ADAM12-L屬于ADAMs家族，可參與局部粘連激酶(focal adhesion kinase；FAK)的激活，通過FAK/c-Jun軸進一步增加其轉錄表達，二者之間形成一個正反饋回路，不斷放大腫瘤細胞—基質相互作用信號，導致食管癌具有高度侵襲性表型，促進轉移。

TCF7L2(transcription factor 7-like 2)和早期生長應答因子1(early growth response 1，EGR1)通過ERK1/2依賴的途徑參與脂鈣蛋白2(high level expression of lipocalin 2，LCN2)的轉錄激活，增強轉移侵襲能力[25]。

非編碼RNA不僅參與腫瘤生長的調控，在腫瘤侵襲、轉移的過程中同樣發揮重要調節作用。Zhang等[26]的研究發現位于染色體11q13.3上的MiR-548k過表達與患者總生存期差相關聯，MiR-548k的特定區域可與ADAMTS1 MRNA的3′-UTR結合抑制其蛋白表達，游離VEGF-C的增加調節腫瘤微環境，促進腫瘤組織淋巴細胞生成和淋巴轉移。相反，MiR-874-3p作為一種抑癌因子，作用于信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)抑制EC細胞發生遷移[27]。MiR-128-3p下調可靶向作用于ZEB1激活EMT過程，增加EC浸潤轉移風險[28]。在其啟動子區域上含有CpG島的3種基因出現高度甲基化可介導抑癌因子MiR-124表達降低[29]。ESCC患者血清MiR-1290水平顯著升高與淋巴結轉移有關聯，可作為淋巴結轉移的生物標志物[30]。

近些年，一些研究發現LncRNA CASC9、LncRNA DUXAP8、LncRNA 01296在食管癌組織中表達升高并促進體外腫瘤細胞浸潤遷移的發展過程，生存分析提示預后不良[31-33]，需要更進一步探究功能并闡明其分子機制。

3 與腫瘤復發有關指標

改善預后結局的重要途徑是根據病情給予評估，制定治療方案后，通過隨訪檢測，準確預測復發風險。傳統臨床成像和分期工具，如COM-Puter斷層掃描、內鏡和內鏡超聲檢查在臨床應用普遍，但靈敏度低也為診療帶來難度。

在初診和治療期間盡早發現轉移性腫瘤細胞對預后判斷更具有優勢。一項前瞻性研究報道外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)可作為獨立預后指標。和骨髓播散腫瘤細胞(disseminated tumor cells，DTCs)相比，CTCs陽性狀態是導致疾病復發和整體生存期縮短的重要獨立因素[34]。針對淋巴結轉移及遠處轉移狀態不詳的病人，評估CTCs狀態更有臨床價值，根據CTCs表達識別風險等級，可以進一步強化多學科綜合治療來降低死亡率。

成纖維細胞生長因子4(fibroblast growth factor 4，FGF4)是胚胎發育過程中的重要細胞因子，利用熒光原位雜交技術發現FGF4在食管癌組織中擴增。FGF4擴增與食管癌復發有關，是行根治性切除術后患者的獨立預后指標。尤其針對Ⅲ期患者，FGF4擴增有助于風險分層，幫助醫師進一步明確最佳治療策略。在未來，FGF4擴增與臨床TNM分期的結合可能作為準確預測ESCC患者5 a死亡和復發概率的預后模型[35]。

針對食管癌術后患者，Shinichi等[36]發現copine 5低表達組生存期較短，可成為監測腫瘤復發的一項重要獨立指標，尤其是局部復發者。Hayato等[37]認為，黑色素瘤特異性抗原(preferentially expressed antigen of melanoma，PRAM)可能與其他基因協同作用促進食管癌的血源性傳播，有望成為預測血源性復發的生物標志物。

4 與腫瘤耐藥有關指標

腫瘤細胞對化療藥物出現耐藥是導致臨床治療效果不理想的主要原因之一。某些分子在腫瘤耐藥機制中發揮特殊作用，影響預后。

C-末端結合蛋白-2 (CtBP2)是一種與腫瘤發生、進展相關的轉錄抑制因子。CtBP2通過抑制促凋亡相關蛋白p53、Bax、activated caspase-3，增加Bcl-2抗凋亡蛋白水平來降低食管鱗癌細胞對化療藥物順鉑的作用敏感性[38]。但該研究僅針對單株細胞系，需要對其他類型EC細胞行進一步研究證實。

ALC1，又名染色質解旋酶DNA結合蛋白1樣基因(chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene，CHD1L)，屬于具有調控基因轉錄功能的SNF-2類家族，是該家族中唯一具有致癌作用的基因[39]。沉默該基因可抑制腫瘤糖酵解過程，抑制腫瘤細胞生長，增強順鉑殺傷腫瘤細胞毒性作用。而沉默丙酮酸脫氫酶復合體E1α亞單位(pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit，PDHA1)基因則可促進Warburg效應，增強EC細胞惡性行為和耐藥性[40]。

5 與腫瘤免疫有關的標志物

隨著腫瘤免疫相關理論的深入研究，基于免疫應答的新型療法使腫瘤治療發生革命性轉變，對判斷預后具有指導意義。除PD-1及CTLA-4外，人們逐漸探索發現了新的免疫檢查點。

吲哚胺2，3-二加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO1)通過下調NK細胞受體及限制T細胞發揮功能，誘導食管癌發生免疫耐受反應。Yuki等對305例行食管癌切除術患者的腫瘤組織行免疫組織化學分析，發現陽性組總體存活率、無病生存率明顯縮短，根據多因素模型IDO1陽性率與總死亡率升高呈顯著相關(HR=1.75，P=0.036)[41]。IDO1獨立于PD1/PDL-1途徑，可聯合其他靶點對治療、預后起指導作用。

B7-H6是B7家族的新成員，與NK細胞表面的活化受體NKp30結合激活TNF和IFN介導的NK細胞殺傷腫瘤細胞[42]。91.72%ESCC組織中存在B7-H6蛋白表達，高表達患者生存差，可作為ESCC的獨立預后標志物[43]。但該實驗有一定的局限性，存在選擇偏倚及混雜偏倚，需要進一步驗證。

淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)存在于腫瘤浸潤淋巴細胞、NK細胞、B細胞[44]，與PD-1同被認為是免疫抑制性受體[45]。一項研究報道稱LAG-3表達與腫瘤臨床分期顯著相關，高表達預示患者的預后較差，尤其對于判斷早期食管癌患者(T1-2、N0、Ⅰ～Ⅱ期)的臨床預后具有重要意義[46]。

6 單一標志物預測生存期

易位融合基因AF1Q位于人體染色體1q21，可通過下游靶點WNT和STAT3促進腫瘤發生進展。對278例手術切除的EC標本進行研究發現接受新輔助治療后AF1Q表達較高(P=0.0002)。根據Cox回歸分析顯示，在高表達患者中，疾病復發和疾病特異性死亡的風險要高出正常人1.5倍，是食管癌預后不良的獨立預測指標[47]。

利用全血行基因組DNA提取檢測，發現食管鱗癌患者染色體9p21上兩個鄰近的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因CDKN2A/2B發生遺傳變異，rs1333049位點多態性與預后不良明顯相關，CC基因型攜帶者總生存期明顯縮短[CC基因型(34.5±8.9)個月VS CG+GG基因型(47.7±5.9)個月，P=0.03][48]。

瞬時受體電位V型(transient receptor potential vanilloid，TRPV2)作為膜蛋白也可通過調節細胞內Ca2+變化影響腫瘤發展進程。術前高表達TRPV2患者組，其5 a總生存率低于低表達組(59.5% VS 85.2%)，術后復發5 a生存率也明顯低于低表達組(46.6% VS 0.0%)，且統計學均有意義[49]。

單一標志物的檢測過程雖然較為簡單、快速、高效、經濟，但大多數單一腫瘤標志物敏感性或特異性偏低，存在漏診和誤診的可能性，難以準確反映腫瘤的復雜性。

7 多種標志物組合預測生存期

腫瘤發生發展過程涉及步驟多、機制復雜，一套組合生物標志物可以更全面地評估患者預后。

Yu等[50]檢測PLCE1、IKBα和P53這3種蛋白在癌組織中普遍高表達，隨訪發現3種表達均呈陽性則總生存期短，預后差(P=0.009)。3項聯合檢測建立的預后效能模型(AUC=0.624)可作為國際TNM分級評估預后(AUC=0.670)的完善與補充。

作為特殊的表觀遺傳修飾方式之一，含有賴氨酸殘基的組蛋白可通過高度甲基化參與染色體調節、基因表達、細胞周期調控等，其異常表達可導致腫瘤發生。如H4K20me3、 H3K9me3、 H3K36me3分別與腫瘤浸潤深度、淋巴結侵犯和分期密切相關。與單一指標相比，三者聯合應用為評價ESCC患者預測預后指標提供證據[51]。

8 總結

腫瘤細胞合成或分解產生的一些生物活性物質，包括DNA片段、非編碼RNA、蛋白質、酶、激素和代謝物等，均可作為生物標志物。不同于內鏡組織病理學及影像學手段，檢測生物標志物作為非侵入性評估方式，避免給患者帶來不必要的疼痛及輻射。血漿腫瘤外泌體體外穩定、易于收集，攜帶囊泡物質含有大量生物學信息，特異度和敏感度優于傳統的生物標志物。MiRNA、LncRNA、ctDNA、CTCs等作為新興標志物也能夠提供更多與腫瘤預后及治療相關的信息。

然而目前的研究結果多為小規模試驗，部分生物標記物的特異性和敏感性仍在爭論中，比起單一檢測某指標，更傾向于多種標志物聯合應用進行評估，在今后需要大規模、前瞻性的臨床試驗數據予以支持。

隨著對食管癌發展機制的研究，更多預后生物標志物會被發現，指導臨床工作，使患者受益。