牙齦卟啉單胞菌Gingipains對宿主細胞外膜蛋白的作用

張秀森，劉怡文，孔金玉，郭藝博，孫玲云，褚洛頤，原 翔,2，高社干,2，侯旭榮

牙周炎是一種由革蘭氏陰性菌引起的慢性口腔炎癥性疾病，疾病表現為牙齦出血、牙齦組織和牙槽骨嚴重發炎，最后導致牙齒脫落。此外，感染牙周炎還會增加類風濕關節炎、動脈粥樣硬化、癌癥和早產的風險，從而影響全身健康。普遍認為，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是革蘭氏陰性專性厭氧的產黑色素桿菌，是引起牙周炎的主要病原體，它利用半胱氨酸蛋白酶Gingipains作為其主要毒力因子[1]。Gingipains包括兩種具有嚴格精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys)特異性的相關蛋白酶：精氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(arginine-specific cysteine proteinase,Rgp)，以RgpA和RgpB兩種形式存在，分別由RgpA和RgpB基因編碼；賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(lysine-specific cysteine proteinase,Kgp)，由Kgp基因編碼[2-3]。RgpA基因編碼的蛋白質由N末端前肽體，相對分子質量4.5×104的精氨酸特異性鈣穩定性的RgpA催化結構域和4個序列相關性的黏附結構域RgpAA1、RgpAA2、RgpAA3和RgpAA4組成。RgpB基因編碼的RgpB蛋白由N末端前肽區和催化結構域構成，無C末端黏附結構域。Kgp基因編碼的蛋白質由N末端前肽體，相對分子質量4.8×104的賴氨酸特異性Kgp催化結構域和5個C末端黏附結構域KgpA1、KgpA2、KgpA3、KgpA4和KgpA5組成。RgpA和RgpB之間的主要區別在于前者形成了一個大型非共價的催化和血凝素/黏附(hemagglutinin/adhesion,HA)結構域，有時被稱為HRgpA。RgpB是一種單鏈蛋白，其氨基酸序列與RgpA催化結構域幾乎相同。Kgp也含有HA結構域，它與HRgpA相關結構域相互作用，形成一種非常有效的蛋白水解復合物，稱為HRgpA-Kgp。因此，Gingipains對牙周的細菌存活和感染的病理結果都很重要。Gingipains是Pg黏附系統的一部分，該系統介導其黏附到口腔表面，負責獲取生長所必需的營養物質以及免疫逃避。此外，Gingipains可以通過降解補體成分和免疫受體，以及通過滅活或激活各種細胞因子來破壞宿主的免疫反應。此外，Gingipains還能降解宿主細胞表面的蛋白，從而導致細胞脫落和失巢凋亡[1,4]。

Gingipains切割宿主細胞表面蛋白和釋放膜蛋白可溶結構域的能力形成了Gingipains可以作為脫落酶的觀點[5-6]，也可作用于其他細菌[7]。胞外結構域脫落是通過金屬蛋白酶TACE(TNF-α轉換酶，也稱為ADAM17)生成可溶性腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[8]。一般來說，所有的脫落酶都能將膜錨定蛋白的全部胞外結構域切割得非常接近膜(多達20個氨基酸殘基)，導致可溶性胞外域釋放到細胞外環境中，后者可能具有新的生物學作用。這最初被證明是來自ADAM(一種去整合素和金屬蛋白酶域)和基質蛋白酶MMP家族的金屬蛋白酶[9]，但后來也被證明可以是其他類型的金屬蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶，如組織蛋白酶G和中性粒細胞彈性蛋白酶和半胱氨酸組織蛋白酶[10-11]。

由于蛋白酶信號是通過降解后其底物功能的調節來介導的[12]，因此本文重點研究牙周炎中Gingipains介導的信號傳導。雖然降解是一種簡單的方式，通常只會導致底物功能的喪失，但有限的處理(如膜錨定蛋白脫落的情況下)是一種更復雜的方法，會導致信號改變，這可能與宿主防御系統的顛覆有關。因此，細菌分泌的Gingipains是否主要降解其膜錨定的底物，是僅在一個位點或很少的位點降解它們，還是通過兩種過程的組合來起作用，可能取決于疾病所處的階段。但是，對Gingipains的生物學降解模式進行詳細分析并不容易，因為大多數研究都是在受控條件下體外進行的，通常也與外源添加的Gingipains一起進行。

1 Gingipains底物

Gingipains可以從不同細胞膜分離出3種蛋白質：免疫調節蛋白、黏附蛋白和信號蛋白。這與Gingipains蛋白酶的水解活性相一致，該活性負責Pg的免疫逃逸、宿主細胞的脫離和隨后的組織降解以及對牙齦細胞中眾多信號通路的調節[4]。

2 免疫調節蛋白

Gingipains針對的是細菌感染免疫反應不同途徑中的許多蛋白質。這些分子參與對入侵者的天然免疫即時反應或參與適應性免疫，甚至介導免疫兩個分支之間的相互作用。總之，它們負責從體內有效地清除細菌。在這些蛋白質中，免疫調節蛋白是在Pg感染過程中被鑒定出的已知Gingipains宿主細胞表面底物中最大的一組。這些免疫調節膜蛋白包括非自身分子的受體，如髓系細胞觸發受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM-1)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)受體CD14，保護細胞不被巨噬細胞吞噬的受體或信號，如CD31、T細胞受體CD2、CD4和CD8，以及免疫反應激活產生的分子的受體，如補體成分(如CD46補體抑制劑)和細胞因子(IL6-R、TNF-α和CD27)。大量的膜免疫調節分子被Gingipains靶向、降解或脫落，進一步表明Gingipains的主要任務是幫助Pg逃避宿主免疫系統。

相當多的底物是先天免疫的一部分，或者至少與之緊密相連。TREM-1是巨噬細胞和多形核中性細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)表達的細胞表面受體。它在宿主細胞識別細菌后被激活，導致細胞因子的產生和炎癥作用增強。當分離的PMNs用Pg處理時，發現Rgp是導致TREM-1從表面脫落的原因，而Kgp被證明可在條件培養基中緩慢降解可溶的TREM-1分子[13]。盡管如此，可溶性TREM-1在細胞液中穩定存在一段時間，可能調節炎癥程度[14]，提示其降解可能與生理相關。對于CD14、單核細胞和巨噬細胞上的LPS受體，卻不盡相同。據說，血凝素/黏附結構域有助于提高Gingipains對CD14的蛋白水解活性。因此，具有這些結構域的Kgp和HRgpA對CD14的降解效率更高，隨后釋放的CD14被Gingipains完全降解，沒有任何生物活性[15-16]。這與Gingipains作為一種病理生理學相關途徑而使CD14脫落是相反的，特別是CD14一旦從細胞表面釋放出來，就沒有了生物學功能，因此無論是完全降解還是功能喪失都無關緊要，這是CD14在細胞膜上降解的結果。在這兩種情況下，CD14的功能喪失都會導致慢性炎癥，這對牙齦組織中的嗜炎性細菌是有利的[17]。

補體系統是先天免疫的另一個重要部分，也是身體中非常強大的病原體檢測器，它是Gingipains的靶點。在膜補體蛋白中，CD46和C5aR為Gingipains的底物。CD46是一種補體抑制劑，廣泛表達在宿主細胞上，是補體系統的“不認識我”信號。Pg最初從上皮細胞表面降解出CD46，但經長時間孵育后，檢測不出可溶性CD46[18]。Pg可能與其表面降解的碎片結合，保護其自身免受補體攻擊。然而，在較高的濃度和較長的暴露時間下，觀察到該分子完全降解，這表明Gingipains介導的CD46降解是存在時間和濃度依賴的。此外，在體內，Gingipains引起的CD46對上皮細胞的降解甚至可能導致補體介導的牙齦上皮損傷，從而有利于細菌侵入牙齦組織。

另一種補體受體是C5a受體(complement component 5a receptor,C5aR)，它由Gingipains蛋白水解處理。C5aR與補體激活后釋放的一種強有力的趨化劑C5a結合，導致PMNs激活，隨后將炎癥和細菌從系統中清除。Kgp對PMNs表面C5aR的N-末端區域的消化作用最強。盡管有這種降解，C5aR仍可以結合C5a。另一方面，Rgp在降解C5aR方面效率不高，可能是因為連接C5aR胞外區和跨膜片段上沒有暴露的Arg殘基。當所有Gingipains都存在時，它們會協同作用，降解C5aR。一個合理的解釋是，Kgp首先將受體從細胞膜上脫落，然后在后者上發生構象變化，導致Arg殘基暴露在細胞表面，從而使其最終被Rgp降解[19]。因為參與的Toll樣受體與C5aR之間存在交互作用，Kgp對C5aR蛋白水解失活似乎適得其反，導致吞噬細胞失去殺菌活性[20]。然而，在體內，C5aR的失活及其隨后的降解，可能在某種程度上協同Pg阻止免疫細胞的正面攻擊，促進其在發炎的牙周組織的惡劣環境中成長。

另一組Gingipains的靶點是巨噬細胞上的受體，因為后者在清除感染或改變的宿主細胞方面起著重要作用，這些蛋白的脫落可能會對巨噬細胞的功能產生嚴重的影響。一種是表達在PMNs上的CD31。它與巨噬細胞的同型相互作用決定了PMNs的命運。存活的細胞在相互作用后立即分離，而凋亡的細胞仍然附著在巨噬細胞上，并經歷吞噬作用。Rgp可以通過巨噬細胞將CD31識別為“吃我”信號，保持附著在完全健康的PMNs上并吞噬它。這可能不僅是Pg用來逃避PMNs清除的另一種方式[21]，而且是其危害和劫持先天免疫力的整體過程的一部分，這有益于牙齦細菌菌落的生長。

獲得性免疫是宿主抵御病原體的一種防御機制，是在先天免疫之后觸發的。由于Gingipains的主要任務是免疫顛覆和逃避，所以Gingipains可以損害包括T細胞在內的免疫細胞反應。T細胞受體(T cell receptor,TCR)的輔助受體CD4和CD8都被證明是Gingipains的底物。據報道，用Pg生長的培養基處理細胞后，HRgpA中CD4和CD8的含量呈濃度依賴性下降[22]。CD2是一種單鏈糖蛋白，是另一種可以被Rgp和Kgp切割的T細胞受體，因為它含有幾個Lys和Arg殘基[23]。然而，沒有關于這些蛋白質的降解結構域或蛋白水解片段在降解后的信息。

細胞因子是對病原體免疫反應的另一個重要部分，它們在細胞之間傳遞信號。因此，Gingipains作為Pg的主要毒力因子，具有降解和滅活細胞因子及其受體的能力。白細胞介素6受體(IL-6R)是Gingipains蛋白水解活性的靶點之一。目前尚不清楚是否會發生脫落和隨后的降解，或者Gingipains會直接降解膜上的IL-6R，但無論如何，受體的結合能力都會喪失[24]。CD27是CD70細胞因子的T細胞受體，對T細胞活化非常重要。用Gingipains處理T細胞后，培養上清液中可溶性CD27大量積聚。在Gingipains中，HRgpA對CD27的脫落作用最強，其次是Kgp。然而，經過長時間的處理后，可溶性形式被完全降解[25]。腫瘤壞死因子-α也被稱為Gingipains底物。HRgpA使膜形式的TNF-α從巨噬細胞表面脫落，而RgpB在降解新形成的可溶性TNF-α方面更為有效。因此，降解片段不會在培養基中積累，并失去TNF-α活性。另外，據推測，Gingipains至少部分降解了TNF受體(TNFR)。TNFR-Ⅱ和TNFR-Ⅱ也都含有大量的Arg-和Lys-殘基，它們是Gingipains的潛在切割位點。這種降解與TNF-α蛋白水解一起會導致原始TNF-α與細胞之間的通訊和相互作用受損，從而導致宿主反應減弱[26]。

3 黏附蛋白

黏附蛋白構成了Gingipains的另一組膜錨定底物。其中最重要的是鈣黏蛋白、整合素和細胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)。由于黏附蛋白在建立細胞與細胞的接觸中起著重要作用，因此通過切割黏附蛋白，Gingipains很可能通過分解黏附蛋白使細胞與周圍環境分離，從而誘導失巢凋亡，這是細胞程序性死亡的一種特殊形式[4,27]。

鈣黏蛋白是鈣依賴性黏附蛋白，對細胞—細胞連接很重要。上皮細胞上的N-鈣黏蛋白僅被HRgpA和Kgp切割(但不被RgpB切割)成幾個較短的片段。另一方面，VE-鈣黏蛋白被所有Gingipains切割，其中HRgpA起主要作用[28-29]。E-鈣黏蛋白與閉合蛋白對細胞—細胞和細胞—細胞外基質的黏附以及上皮細胞的細胞極性起重要作用，并且這兩種蛋白質都是Gingipains的靶點。Kgp被認為是上皮E-鈣黏蛋白降解的最大貢獻者，而閉合蛋白則被所有Gingipains降解[30]。在所有這些例子中，鈣黏蛋白都被完全降解，這肯定會對牙齦或牙齦溝上皮的完整性產生不利影響，促進細菌及其有害產物擴散到牙齦和牙周組織中。然而，E-鈣黏蛋白被發現可由幽門螺桿菌HtrA1蛋白酶分泌，這可能與細菌感染有關[7,31]。

Gingipains靶向的下一組黏附分子是整合素，整合素是一種通過細胞內結構域將細胞外基質(extracellular matrix,ECM)與周圍細胞連接起來的蛋白質。HRgpA主要降解β-1整合素亞基，而Rgp主要降解整合素α2和β3[32-33]。細胞和細胞外基質之間的這些連接被發現是通過失巢凋亡觸發細胞死亡的，這也是組織破壞的一個原因。此外，細胞外基質本身可以被Gingipains蛋白水解處理。不同的成分有不同的Gingipains降解傾向。例如，通過用Gingipains處理，可以使纖維連接蛋白大量降解，從而阻止纖維連接蛋白與纖維連接蛋白受體α5β1整合素的結合[33-34]。然而，關于ECM的主要成分之——Ⅰ型膠原，作為Gingipains的潛在靶點，有相互矛盾的信息。雖然有幾份報道描述了Gingipains能降解它，但也有其他報道的相反說法[35]。然而，隨后對分離的Ⅰ型膠原進行的實驗證明，與Kgp形成的復合物中的HRgpA實際上可以降解Ⅰ型膠原[36-37]。然而，應該注意的是，這些實驗是在體外用純化的Gingipains和重組或分離的膠原蛋白進行的，不一定保留底物的天然三螺旋結構。

此外，Gingipains還通過Gingipains依賴的其他因子的激活，間接參與細胞外基質的降解，進而刺激其他細胞外基質降解蛋白酶，如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)。其中一種因子是細胞外基質金屬蛋白酶誘導物(extracellular matrix metalloproteinase Inducer,EMMPRIN)，它表達在上皮細胞和腫瘤細胞表面，它的膜結合形式和可溶性形式都能與成纖維細胞相互作用，誘導MMPs的分泌。Feldman等[6]證明，Pg處理上皮細胞系會導致EMMPRIN脫落。可溶性EMMPRIN是穩定的，并且沒有進行進一步的蛋白水解。但是，可溶性EMMPRIN從細胞表面釋放的任何病理生理學過程均不清楚。

Pg盡管通常在口腔中發現，但在牙齦出血時可以進入血液，然后播散并引發新的炎癥。因此，Gingipains可以蛋白水解處理內皮細胞黏附分子也就不足為奇了。其中內皮黏附分子起主要作用的一個非常重要的事件是白細胞從血液中遷移到炎癥組織中。這是通過內皮細胞和遷移的白細胞之間的一系列黏附事件發生的。其中，ICAM-1、VCAM-1和PECAM-1在這些步驟中非常重要。內皮細胞上的血小板內皮細胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)對Gingipains的降解具有時間和劑量依賴性。因此，可以得出結論，Gingipains直接降解內皮細胞表面的PECAM-1[38]。參與白細胞跨血管遷移的內皮細胞表面蛋白CD99也顯示了同樣的結果，它被認為在同型細胞黏附中起重要作用[39]。細胞內黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表達在多種細胞上，包括內皮細胞和牙齦上皮細胞，感染開始時，Gingipains會直接降解ICAM-1[40-41]。總之，CAMs是Gingipains非常重要的目標，因為其降解會阻礙白細胞流入炎癥和感染部位，從而阻止細菌的有效清除。

4 細胞信號蛋白

Gingipains的另一個作用是干擾宿主信號傳導途徑。通過這些方法，Gingipains破壞了局部信號，并使它失去功能，無法起到保護作用和清除細菌的作用。其中最知名的Gingipains底物是生長因子受體，例如多聚體蛋白聚糖(syndecan-1)、凝血途徑成分和蛋白酶激活受體(protease-activated receptors,PARs)。

Syndecan-1是細胞表面蛋白多糖，是多種生長因子和細胞外基質蛋白的共同受體。當降解時，胞外區域可以起到炎癥調節的作用。Andrian等[5]證明了用Pg上清處理牙齦上皮細胞增加了培養基中可溶性sycndecan-1的量。此外，釋放的完整胞外域可能有助于解除先天防御機制的武裝，從而促進Pg逃避免疫清除[42]。

Gingipains干擾的另一個信號傳導途徑是凝血途徑。盡管Gingipains干擾該途徑的幾個成分，但血栓調節蛋白是唯一的膜錨定靶點。血栓調節蛋白是一種內皮表面糖蛋白，結合凝血酶，然后進一步調節凝血抑制作用。Gingipains從內皮細胞系表面脫落血栓調節蛋白，但釋放的可溶性蛋白不具備進一步調節凝血途徑的能力，并且可能被降解[43]，這可能會加重感染Pg的牙周炎部位的出血傾向。

PARs是一組膜G蛋白偶聯受體，在其N端被宿主蛋白酶進行蛋白水解切割后，進行信號傳導。但是，Gingipains也具有降解和激活PARs的能力。目前已知有4種PARs，即PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，它們都曾被報道為Gingipains底物。Gingipains可以激活血小板表達PAR-1、低表達PAR-4，其中HRgpA最有效，其次是RgpB[44]。在上皮細胞上，可以找到PAR-1、PAR-2和PAR-3。具有Arg特異性的RgpB可以激活PAR-1和PAR-2，但對PAR-3沒有影響。后者在降解位點含有Lys殘基，因此只能被Kgp激活，但未被證實[45]。Gingipains激活的PARs既不脫落也不降解，它僅僅在特定切割位點使有限的蛋白水解，可導致信號傳導途徑被激活，并可能導致血小板激活及其聚集或誘導不同的白介素。所有這些都會導致宿主細胞免疫系統紊亂以及細菌清除不成功。在這種情況下，PARs在牙周組織的穩態中起著非常關鍵的作用[46]，而且PAR-2對于牙周炎的發病機制至關重要[47]。

5 結論

Gingipains因其蛋白水解活性而起到逃避或調節宿主免疫防御的作用。為了闡明Gingipains切割靶點的機制，本文討論了Gingipains的3組不同的靶點膜蛋白。所有Gingipains底物的降解/加工都是相互協同的，其目的都是幫助Pg在宿主口腔中生存。因此，Gingipains的主要功能是誘導宿主蛋白的功能喪失。至于蛋白質是通過一次裂解失活，還是額外加工，甚至隨著時間的推移而降解，似乎與疾病進展有關。在早期階段，Pg在口腔中的數量很少，而Gingipains的濃度較低，因此只在一個或少數幾個靶點降解底物。后來隨著Gingipains濃度增高，并主要降解細胞膜靶點，從而接管了許多宿主免疫反應調節和信號傳導途徑，逃避和破壞了免疫系統，最終導致組織破壞。

(致謝：感謝孫蔚、梁嘉等人提供的幫助！)