福建省蛇舌形蟲18S rRNA基因的擴增及蟲種鑒定

宋肇程，黃瀟航，夏錫銳，黃志堅，殷光文

(1.福建農林大學動物科學學院，福建 福州 350002；2.福建省動物藥物工程實驗室，福建 福州 350002；3.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642)

本試驗通過對福建省三明市的某蛇場得到的死亡病蛇進行剖檢，觀察其器官的病變，并從其肺臟采集到的1對蟲體，初步懷疑為舌形蟲病。之后對采集的蟲體和腸道結節的18S rRNA基因序列進行PCR擴增、測序，并與NCBI數據庫中的相應序列進行比較分析，從而對樣品進行分子鑒定。為舌形蟲的分子鑒定提供了科學根據，也為將來同類的研究提供借鑒、例證。

1 材料與方法

1.1 樣品材料 樣品為采自福建省三明市某蛇場1條病死蛇。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit、高保真酶TransStart?FastPfuFlyDNA Polymerase高保真DNA聚合酶、EasyTaqMix聚合酶、膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEASY-Blunt Simple載體、Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態細胞，均購自北京全式金生物技術有限公司。凝膠成像系統(Omega Fluor Plus藍光凝膠成像系統)由Aplegen公司生產，PCR儀由基因有限公司生產。電泳系統由北京市六一儀器廠生產。

1.3 病變與病原觀察 剖檢眼鏡蛇尸體，肉眼觀察肺臟與腸道，檢查是否發生病變、結節。檢查病變器官是否存在寄生蟲蟲體，并進行觀察。

1.4 樣本DNA提取及PCR擴增目的片段 將蟲體和腸道結節按FastDNA SPIN Kit試劑盒說明書所述方法，提取基因組DNA。采用引物(NEMF1：5′-CGCAAATTACCCACTCTC-3′；S3：5′-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3′)、TransStart?FastPfuFlyDNA Polymerase擴增酶進行擴增，反應體系為50 μL體系(DNA模板6 μL，上下游引物各1 μL，TransStart FastPfu Fly 1 μL，DNA Buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，ddH2O 27 μL)。PCR反應程序：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 20 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 1 min)×30個循環；72 ℃ 5 min；擴增時設陰性對照。擴增結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.5 PCR產物純化、克隆及篩選 使用膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit，按照說明書進行PCR產物純化。后連接于pEASY-Blunt Simple載體上轉化至Trans I-T1感受態細胞中進行擴增，涂板培養過夜，挑取單個菌落培養，用EasyTaqMix和M13F/M13R引物進行PCR擴增后挑選出陽性菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 系統進化分析 將測序得到的基因序列與NCBI中公布的相關基因序列進行對比分析并繪制序列系統發生樹。

2 結果

2.1 病變與病原觀察 病蛇呼吸困難，有張口呼吸的情況，同時拒食。剖檢病蛇尸體發現，病變部位主要集中在肺臟和腸道(見中插彩版圖1)。在剖檢時發現肺臟上有1對寄生蟲蟲體(見中插彩版圖2)，蟲體為蠕蟲狀，略呈圓柱形，細長，約有7.55～7.61 cm。顏色為乳白色略有發黃，半透明狀。頭尾較尖細，中間部位較粗，肉眼未見到明顯的體環。體壁柔軟，略有彈性。口器位于蟲體頭部，口周圍有4個口鉤，頭胸部之間較細，可見1條貫穿于蟲體的消化道，消化道內有黑色內容物。對腸道結節進行壓片鏡檢發現存在有鉤狀結構的寄生蟲(見中插彩版圖3)。根據對病蛇器官組織病變以及蟲體的觀察，初步懷疑為舌形蟲病。

2.2 基因片段的擴增結果與序列分析 以TransStartFastPfuFlyDNA Polymerase擴增酶，采用特異性引物(NEMF1，S3)對基因進行擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示基因片段均在750 bp左右(見圖4)。

圖4 舟山眼鏡蛇舌形蟲 18S rRNA基因序列PCR擴增產物電泳分析

試驗篩選的陽性菌落經生工生物工程(上海)股份有限公司測序后得到舟山眼鏡蛇肺部寄生蟲成蟲和腸道結節的18S rRNA序列，序列全長均為770 bp，與NCBI的Nucleotide BLAST公布的相關序列比較可知，其18S rRNA基因序列與GenBank中的EU370434.1(Raillietiellasp.1 BMR-2008 strain C129)；AY744887.1(Raillietiellasp.MCZ DNA101107)的舌形蟲相似性為99.74%；與KC904945.1(Raillietiellaorientalis)的舌形蟲相似性為97.40%；與JX088397.2(Linguatulaserrateisolate NoDog1)的相似性為93.51%。由此可證明，從福建舟山眼鏡蛇中發現的舌形蟲為Raillietiella屬的寄生蟲。

經GenBank檢索10種有代表性的舌形蟲、作為外群的一種闊節裂頭絳蟲的18S rRNA進行相似性分析。舌形蟲序列的序列號分別為：EU370434.1、AY744887.1、AY304521.1、AY304520.1、KC904945.1、KU975377.1、KU975376.1、KU975375.1、KU975378.1、JX088397.2，闊節裂頭絳蟲序列號為：KF218251.1。使用DNASTAR 7.1軟件的Megalign程序對以上序列進行比對，可以看出各個序列之間的相似性與差異性的百分比。此次分離到的成蟲和腸道結節中的序列相似性為100%，與GenBank中舌形蟲之間序列相似性在91.7%～99.6%；與闊節裂頭絳蟲Diphyllobothrium latum(序列號：KF218251.1)的相似性低于70.9%(見圖5)。

圖5 舟山眼鏡蛇舌形蟲與其他舌形蟲基因序列相似性對比圖

選取18S rRNA基因序列使用MEGA 7.0軟件繪制序列系統發生樹(見圖6)。通過種系發育分析顯示：福建舟山眼鏡蛇肺部舌形蟲18S rRNA基因序列與EU370434.1、AY744887.1和KC904945.1的親緣關系比較近。與AY304521.1和AY304520.1同屬于一個大的分支。與其他舌形蟲的親緣關系稍遠。由此可確定該株為Raillietiella屬的舌形蟲。

圖6 舟山眼鏡蛇舌形蟲18S rRNA基因序列系統發生樹

3 討論

舌形蟲主要寄生蛇類等食肉爬行動物的呼吸系統中，也會感染蟾蜍、鳥類以及包括人類等在內的哺乳類動物[1-3]。人類舌形蟲病主要經食物或水源傳播，與終末宿主的密切接觸也可能造成感染[4]。舌形蟲病分為內臟型和鼻咽型2個型[5]，可以引起腹痛、腹瀉、嘔吐、肝腫大、黃疸以及肺葉空洞等[6-9]。除國內報道過的尖吻蝮、滑鼠蛇等和本實驗室此次發現的舟山眼鏡蛇外，在澳大利亞、巴西和北美等地也有蛇類舌形蟲病的報道[10-11]。可見舌形蟲已經存在較為廣泛的分布。

本試驗采用形態學和分子生物學的鑒定方法對舟山眼鏡蛇的舌形蟲進行了鑒定。利用高度保守的18S rRNA基因的特異性引物對舟山眼鏡蛇的舌形蟲蟲體和蛇腸道結節的18S rRNA基因序列進行PCR擴增，測序。結果表明，該蟲體為Raillietiella屬的舌形蟲。且試驗結果顯示，其18S rRNA基因序列種內差異小于種間差異，表明18S rRNA基因可以作為種間遺傳標記來鑒定舌形蟲。我們在舟山眼鏡蛇的體腔中發現的這對成蟲蟲體和腸道結節的PCR和測序結果一致，說明肺臟和腸道具有同時寄生的情況。據Raillietiella舌形蟲已有的生活史研究可知：蟲卵被終末宿主排出，發育為感染性蟲卵被中間宿主吞食，在中間宿主中發育為若蟲，中間宿主被終末宿主吞食后，感染性若蟲在其腸道內進行發育，從腸壁鉆出經體腔移行至肺臟繼續發育成成蟲。這與本試驗的結果相吻合。該養殖場用作飼料的蛙類和雛雞都可作為中間宿主感染，并且場址地處山林，畜舍附近經常有野生的蛙類和鼠類出沒，由此可以推測：養殖場的眼鏡蛇還有誤食感染了舌形蟲的野生動物從而成為終末宿主的可能性。本試驗成功確診福建省三明市某蛇場的舟山眼鏡蛇患有舌形蟲病，為福建省舟山眼鏡蛇舌形蟲的分子生物學研究奠定了基礎。此寄生蟲對蛇類和人類都會造成嚴重危害，養殖蛇類尚且存在感染，意味著野生蛇類可能存在更加嚴重的感染。由此提醒相關人員做好防治工作以保證舟山眼鏡蛇的生存質量。由于舌形蟲的生物學分類的研究仍然存在著一定的爭議，所以對于其物種的分類仍有待進一步探索。