雛雞源金黃色葡萄球菌分離及生物學特性鑒定

張召興，李佩國，張海龍，陳 玥，李蘊玉，張香齋，賈青輝

(1.河北科技師范學院動物科技學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 秦皇島 066604；2.河北旅游職業學院畜牧獸醫系，河北 承德 067000)

1 材料與方法

1.1 病料來源 唐山地區某養雞場中16日齡病死的海蘭褐雛雞，無菌采集病死雛雞的肝臟、關節滲出液等病料組織進行細菌分離鑒定。

1.2 主要試劑與儀器 普通營養培養基、營養肉湯菌,均購自北京路橋生物技術有限責任公司；甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，購自青島高科園海博生物技術有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試條，購自Bio-Merieuxsa公司；DL-2 000 Marker，購自北京中生瑞泰科技有限公司；2×TaqMarker Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司。ATB自動化微生物生化鑒定系統由法國生物梅里埃股份有限公司生產；梯度PCR儀由德國Eppendorf 公司生產；隔水式恒溫培養箱由上海一恒科技儀器有限公司生產；7%脫纖綿羊血培養基由本實驗室提供。

1.3 試驗動物 健康1日齡海蘭褐雛雞70只，購自秦皇島市金牧種雞場，飼養至16日齡進行試驗。

1.4 分離培養與鑒定 無菌采集病死雛雞的肝臟、關節滲出液等病料組織接種于7%綿羊脫纖血培養基上，37 ℃恒溫培養12～18 h，挑取單個優勢菌落接種于甘露醇氯化鈉鑒別培養基上，37 ℃恒溫培養12～18 h。挑取單個菌落分別接種于普通培養基和營養肉湯中進行純化培養，取純化培養的分離菌株進行染色鏡檢。

1.5 生化試驗鑒定 按照說明書將純化培養的分離菌調整菌液濃度為2個麥氏濁度，接種于Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試條中，37 ℃恒溫培養24～48 h，用ATB自動化微生物生化鑒定系統進行生化特性鑒定。

1.6 細菌16S rRNA的PCR鑒定 參考文獻[6]設計細菌通用16S rRNA基因序列引物：5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，進行PCR擴增。PCR擴增反應體系為50 μL：2×TaqMix 25 μL,上、下游引物各2 μL,DNA模板3 μL，ddH2O 18 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測其目的條帶，分離菌株的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序，測序結果與GenBank數據庫中登錄基因序列進行同源性比較與分析。

1.7 致病性試驗 取純化培養的分離菌株培養至對數期計數，調整菌液濃度。將60只16日齡健康雛雞分為6組，每組10只，2～6組每只雛雞通過腹腔注射攻毒0.2 mL，濃度分別為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL和1.0×108CFU/mL；1組為對照組給予等量的生理鹽水，攻毒12 h后，觀察7 d，記錄其發病情況和死亡情況。用寇氏改良法計算分離菌株的半數致死量(LD50)。

1.8 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作和結果判斷。

1.9 多重耐藥基因的PCR檢測 參考文獻[5]設計葡萄球菌的多重耐藥基因cfr、fexA和fexB引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的分離菌株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。分離菌株的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序，測序結果與GenBank數據庫中登錄基因序列進行同源性比較與分析。

表1 多重耐藥基因的引物序列

2 結果

2.1 細菌的分離培養 分離菌株在7%脫纖兔血培養基長出了光滑的、邊緣整齊的菌落，形成透明的溶血環，呈現β溶血；在甘露醇氯化鈉瓊脂培養基上長出圓形的、邊緣整齊的淺黃色菌落；在普通培養基上生長出圓形的、邊緣整齊的白色菌落，長時間培養變成金黃色的菌落；革蘭染色鏡檢，可見單個短鏈和成堆的葡萄串狀排列的陽性球菌(見中插彩版圖1)。

2.2 細菌的生化鑒定 分離菌分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，且產酸不產氣；分解馬尿酸鹽、還原硝酸鹽、精氨酸；不分解纖維二糖、阿拉伯糖；并水解淀粉、七葉苷；靛基質試驗陰性；V-P試驗和過氧化氫酶試驗陽性；不產生H2S。

2.3 細菌16S rRNA的PCR鑒定 分離菌株用16S rRNA PCR擴增出大約為1 492 bp的PCR目的基因條帶(見圖2)。分離菌株PCR產物測序結果與GenBank中登錄的參考株金黃色葡萄球菌的基因序列同源性為98.9%～99.9%，分離菌株為金黃色葡萄球菌。

圖2 分離菌株PCR擴增結果

2.4 致病性試驗 試驗組雛雞攻毒后的48～72 h，個別雛雞出現死亡，在死亡試驗雞的肝臟中分離到金黃色葡萄球菌，直到試驗結束，對照組試驗雛雞無明顯的癥狀。2～5組的死亡率分別為30%、70%、90%和100%，其分離菌株的LD50為3.16×106CFU/mL。因此證實了從病死雛雞的體內分離到的金黃色葡萄球菌具有很強的致病性。

2.5 藥敏試驗 由表2可知，分離菌株對頭孢曲松、頭孢拉啶、環丙沙星、恩諾沙星、林可霉素5種藥物敏感，對氨芐西林、阿莫西林、丁胺卡娜霉素、大觀霉素4種藥物中敏，對氟苯尼考、青霉素、新霉素、慶大霉素、多西環素5種藥物耐藥。

表2 藥敏試驗結果

2.6 多重耐藥基因的PCR檢測 由圖3可知，分離菌株均擴增出了多重耐藥基因cfr和fexA目的基因的條帶。其PCR產物測序結果與GenBank中登錄的參考株金黃色葡萄球菌的基因序列同源性為97.9%～99.8%，說明了分離的金黃色葡萄球菌同時攜帶多重耐藥基因cfr和fexA。

圖3 分離菌株多重耐藥基因的PCR擴增結果

3 討論

葡萄球菌是人類和動物體內的正常菌群，廣泛存在于空氣、飲水、飼料中及各種物品和人體的皮膚、黏膜、呼吸道、腸道中等，為環境中條件性致病菌，根據脂溶性色素的生化反應可以分為腐生葡萄球、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌3種，其中，金黃色葡萄球菌主要引起雛雞急性敗血癥和關節炎[4-6]。魏曉巍等[6]報到了從病死的35日齡肉雞肝臟、關節滲出液等病料組織中分離到致病性金黃色葡萄球菌。本試驗從病死的16日齡雛雞體內分離到了1株金黃色葡萄球菌，且對雛雞有很強的致病性，其LD50為3.16×106CFU/mL。葡萄球菌為環境中的條件致病菌，該菌可以通過直接接觸和空氣傳播，還可以通過創傷皮膚和黏膜傳播，雛雞也可以通過臍帶感染傳播[7-8]。因此，在雛雞養殖過程中應注意環境衛生與消毒，加強平時的飼養管理，減少籠內的鐵絲等尖銳物品引起皮膚損傷感染該菌，同時減少外界應激反應、提高機體的抵抗力，減少該病的發生與流行。國內關于肉雞的葡萄球菌病較多，蛋雛雞的葡萄球菌病報道較少。該菌可能對蛋雛雞存在潛在的威脅，應引起重視。

S：敏感; I：中度敏感；R：耐藥

S:Sensitivity; I:Moderate sensitivity; R:Resistance