混合型貓傳染性腹膜炎自然病例的診斷和病理學觀察

王金玲，曹 霞，甘 迪，丁玉林，繆增強，楊龍峰，吉林臺

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.農業部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；3.北京市延慶縣動物疫病預防控制中心，北京 延慶 102100)

貓傳染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是由貓冠狀病毒引起的一種全世界發生的致死性傳染病[1-2]。在貓舍內，貓冠狀病毒感染率為100%，但只有5%～10%的感染貓可發展為FIP[3]。近些年，FIP的病例在世界上一直有報道，且發病率有上升趨勢。雖然多位國內外研究者報道了FIP的病理變化，但觀點不同。為了闡明FIP的特征性病理變化，本試驗確診1例混合型FIP的自然病例，并進行系統的組織病理學觀察。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1只3歲臨床診斷為FIP的病死貓，由呼和浩特某寵物醫院贈予。

1.2 尸體剖檢及取材 通過問診貓主人和查閱醫師病歷記錄了解病死貓生前的臨床癥狀。按貓尸檢術式進行尸體剖檢和大體病變觀察，分別取全身各組織器官，大小為1.5 cm×1 cm×0.5 cm左右，固定于10%中性福爾馬林溶液中，用于組織病理切片制備。

1.3 組織切片制備和組織病理學觀察 固定好的組織進行修塊、脫水和透明，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，蘇木素-伊紅(H.E.)染色，制備病理組織切片和進行組織病理學觀察。

1.4 病毒的RT-PCR診斷和PCR產物測序

1.4.1 引物 FIP病毒的3′ UTR基因片段的特異引物[4-5]，上游引物為5′-GGCAACCCGATGTTTAAAACTGG-3′；下游引物為5′-CACTAGATCCAG-ACGTTAGCTC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 病毒RNA的提取 尸檢時取病死貓的小腸、脾臟和肝臟，分別提取各組織的總RNA，具體操作步驟按照RnaExTMTotal RNA istolation solution(GK3005,GENERAY BIOTECH)說明書進行。

1.4.3 病毒基因組RNA的擴增 cDNA合成：按PrimeScriptTMRT Master Mix(RR036A,TaKaRa BIO INC.)說明書操作。反應體系(10 μL)：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，total RNA 4 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，產物4 ℃保存。

PCR反應體系(50 μL)：2×Per Mix 25 μL，dd H2O 19 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，輕輕混勻。PCR反應條件：95 ℃ 5 min：95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.4 PCR產物測序和同源性分析 PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果在GenBank 數據庫中進行比對。

2 結果

2.1 臨床癥狀 發病貓為3周歲，逐漸表現精神沉郁，食欲降低，體溫39.3 ℃，腹圍逐漸增大，觸診腹部腹腔內有大量腹水。發病后期精神極度沉郁，臥地不起，可視黏膜和皮膚明顯黃染，經過1個月的治療，無任何效果而死亡。

2.2 大體病變 病死貓腹圍明顯膨大，觸診腹壁有明顯的波動感。全身各組織器官因嚴重黃疸而呈黃色。腹部皮膚真皮內表面有較多的大小不等的圓形出血斑點。腹腔內充滿淡黃色半透明較黏稠的腹水，腹腔漿膜面彌漫地附著一層薄厚不均的污黃色膠胨樣滲出物，大量界限明顯的黃白色針尖大小至小米粒大小的結節附著在漿膜面上，一部分結節埋藏在黃色膠胨樣滲出物內，一部分結節相互融合成片，腹腔漿膜面凸凹不平(見封三彩版圖1,2,3)。局部腹腔漿膜面附著黃色絮狀滲出物和散在出血斑點。肝臟腫大，表面呈 “檳榔肝”紋理和散在黑紅色小米粒大小的出血斑點。肺臟腫脹，輕度實變，表面濕潤有光澤，表面和切面分布彌漫性和融合性的質度較實的暗紅色肺炎灶。氣管內充滿白色泡沫樣液體。心肌呈粉白色，心耳外膜散在出血斑點。腎臟腫大，淤血，皮質呈土黃色，無光澤。腸系膜淋巴結腫大，呈黑紅色。腦水腫明顯。

2.3 組織病理學變化 胃、腸(封三插彩版圖4)、肝臟、脾臟(見封三彩版圖5)、胰腺、腎臟、腸系膜和膀胱等器官漿膜面均有一厚層漿液纖維素性滲出物附著，滲出物內有大小不一的炎性細胞浸潤灶(眼觀結節)。浸潤灶內主要有大量淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和少量中性粒細胞，偶見細胞分裂象和少量細胞壞死，較大的浸潤灶內和邊緣可見少量小血管和成纖維細胞增生。腹腔器官漿膜面間皮細胞增生，體積增大，數量增多，呈多形態向臟器表面增生(見封三彩版圖6)。心肌染色變淡，局部心肌纖維間可見淋巴細胞小浸潤灶。肝臟明顯淤血和水腫，狄氏腔顯現，局部有出血灶，肝細胞普遍發生輕度至中度脂肪變性，局部肝被膜下可見大小不等的淋巴細胞浸潤灶。腎小管上皮嚴重腫脹和脂肪變性，局部腎小管上皮細胞壞死，腎間質多見淋巴細胞浸潤灶。肺淤血，肺泡間隔增寬，少量淋巴細胞浸潤，間質成纖維細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞輕度增生，部分肺泡腔內充滿漿液和不同數量的巨噬細胞。胰腺小葉邊緣腺泡壞死和間質淋巴細胞增生明顯。小腸黏膜嚴重壞死。小腦浦金野細胞和大腦神經細胞均有明顯的變性和壞死，小血管周圍出血灶多見。

2.4 RT-PCR結果 從肝臟、脾臟和小腸組織提取的RNA進行RT-PCR，均獲得220 bp左右的目的DNA片段(見圖7)。

圖7 FIP病毒的RT-PCR鑒定

2.5 RT-PCR產物測序結果和同源性分析 RT-PCR產物測序后，從肝臟、脾臟和小腸分別獲得相互同源率為100%的220 bp左右的基因序列，在GenBank數據庫中進行比對，與Feline coronavirus UU17(序列號:HQ012367)有最高同源性，同源率為99%。

3 討論

目前，對于FIP的死后確診主要是通過病理學與病毒抗原檢測[6]。FIP有2種類型，分別為濕型(滲漏型)和干型(非滲漏型)[7]。干型FIP特征病變是在組織器官的漿膜面和實質內的結節性病變(肉芽腫)；濕型FIP的特征病變為胸腹腔內大量腹水形成。在獸醫臨床上，同時表現干型和濕型FIP病理變化的混合型FIP更常見[8]。

該例混合型FIP特征性大體病變為腹腔內充滿淡黃色半透明較黏稠的腹水，腹腔漿膜面彌漫地附著大量界限明顯的黃白色小米粒大小的結節和一層薄厚不均的污黃色膠胨樣滲出物。RT-PCR、測序和基因比對結果表明：所獲得的FIP病毒特異性基因片段與Feline coronavirus UU17(序列號HQ012367)有最高同源性(99%)。

目前，針對干型FIP病例漿膜上出現結節的病理組織學國內外研究者觀點不同。Kipar A,Weiss R C和Crawford A H等認為結節為肉芽腫性炎和/或化膿性肉芽腫性炎[8-10]，Evermann J F報道結節是由淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和中性粒細胞所圍繞的纖維素壞死性病灶[11]，蔣劍成等報道結節為滲出的脂肪空泡[12]和喬明明等報道結節為肉芽腫病變[5]。在病理學上，肉芽腫是一個組織有序的上皮樣細胞(巨噬細胞)聚集性炎灶[13-14]。能引起肉芽腫病變的病因主要為傳染性病原(細菌、真菌和寄生蟲)和外源性物質(縫線和異物等)。根據病因不同，肉芽腫可能含有淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、多核巨細胞、成纖維細胞和膠原纖維(纖維化)。到炎癥后期，傳染性病原引起的肉芽腫中央常形成干酪樣壞死灶，壞死灶的周圍是由上皮細胞和多核巨細胞組成的特殊肉芽組織，肉芽腫的邊緣為結締組織[15]。

通過對本例組織病理學觀察，作者認為腹腔漿膜面的結節是伴有漿液-纖維素性滲出的無有序結構的含有大量淋巴細胞、巨噬細胞[16]，漿細胞和少量中性粒細胞浸潤的炎性細胞浸潤灶，有的炎性細胞浸潤灶內伴有輕度的纖維化，而非肉芽腫病變和脂肪空泡。同時，本試驗還觀察到以肺小葉間質成纖維細胞和Ⅱ型肺上皮細胞輕度增生為特征的間質性肺炎，以淋巴細胞增生和浸潤為特征的間質性肝炎、間質性心肌炎、間質性胰腺炎和間質性腎炎。