某種雞場(chǎng)傳染性喉氣管炎病毒的分離與鑒定

李玉燕，鞏新民，祝永華，左常魁，丁愛(ài)君，包丹丹，江 兵，李 月，郭龍宗

(山東益生種畜禽股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264680)

傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是雞的一種病毒性的呼吸道傳染病，該病能引起雞的死亡率和產(chǎn)蛋量下降，給生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失[1]。其中種雞的ILT 發(fā)病呈世界性分布，世界上許多國(guó)家都有該病的發(fā)病報(bào)道[2-3]，該病在我國(guó)近幾年也呈流行趨勢(shì)，不斷有養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)感染的報(bào)道[4-6]。2019年6月，某種雞場(chǎng)雞群在8周齡時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)呼吸道癥狀，聽(tīng)雞有呼嚕聲、呼吸困難、伸頸喘氣、咳嗽、怪叫。臨床剖檢死雞發(fā)現(xiàn)眼部周?chē)悬S色干酪樣滲出，喉頭、氣管內(nèi)出血，黏液增多，部分雞只氣管內(nèi)有血塊，疑似傳染性喉氣管炎病毒感染。該雞群未進(jìn)行傳染性喉氣管炎病毒免疫。筆者采集死亡雞只氣管、肺、喉頭等組織樣品進(jìn)行病毒的分離與鑒定，雞胚絨毛尿囊膜接種、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和PCR鑒定結(jié)果顯示，該種雞群發(fā)病為ILTV感染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、2 000 bp Marker、瓊脂糖、TAE，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。ILTV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。ILTV疫苗株作為陽(yáng)性對(duì)照，購(gòu)自英特威公司，批號(hào)為94150010，有效期至2020年8月13日。SPF雞胚，購(gòu)自山東益吉達(dá)生物科技有限公司。

1.2 病料處理 采集該種雞場(chǎng)疑似ILTV感染雞只的氣管、肺、喉頭等病料，加入滅菌生理鹽水研磨，直至成5%～10%的勻漿液，加入青霉素、鏈霉素4 ℃作用2 h，凍融3次。將懸液移至離心管中充分搖震后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，用于接種雞胚。

1.3 病毒分離 將經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌的濾液經(jīng)絨毛尿囊膜(CAM)接種15枚10日齡SPF雞胚，每枚接種0.2 mL濾液，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。37 ℃孵化箱孵育6 d，每天照蛋2次，觀察雞胚死亡情況，棄去24 h內(nèi)的死胚。于接種后第6天收集雞胚絨毛尿囊膜，觀察是否有痘斑。若第1代有痘斑，將雞胚絨毛尿囊膜研磨制成勻漿，反復(fù)凍融3次，離心取上清，置-20 ℃保存?zhèn)溆茫糜谔崛NA。若第1代沒(méi)有痘斑，按照同樣方式繼續(xù)傳至第3代。

1.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 用標(biāo)準(zhǔn)的ILTV陽(yáng)性血清作為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗體加入梅花孔中央，分離病毒毒株作為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原加入周?chē)住Ｔ?.5%的瓊脂板上，按照常規(guī)方法打孔、加樣，置37 ℃濕盒中24 h，觀察結(jié)果。

1.5 核酸提取 采集有痘斑病變的雞胚絨毛尿囊膜經(jīng)研磨離心后，取上清液按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit使用說(shuō)明書(shū)提取DNA。

1.6 樣品的鑒定

1.6.1 引物 設(shè)計(jì)合成針對(duì)ILTV的通用PCR檢測(cè)引物，上游引物序列為：5′-GAGTTCGAGAACGATGACTC-3′，下游引物序列為：5′-AGGCAGATGTACGAGTTAGG-3′，擴(kuò)增目的片段大小為530 bp。

1.6.2 目的片段的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、模板DNA 3 μL、ddH2O 7.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 某種雞場(chǎng)雞群在8周齡開(kāi)始出現(xiàn)呼吸道癥狀，聽(tīng)雞有呼嚕聲、呼吸困難、伸頸喘氣、咳嗽、怪叫。該雞群未免疫傳染性喉氣管炎疫苗。臨床剖檢死雞發(fā)現(xiàn)眼部下方有黃色干酪樣滲出物，氣管內(nèi)出血，嚴(yán)重者氣管內(nèi)有出血斑塊，肺臟有大量黏液，疑似傳染性喉氣管炎病毒感染。

2.2 ILTV的病毒分離 將氣管、肺、喉頭等病料組織上清液過(guò)濾除菌后，經(jīng)絨毛尿囊膜(CAM)方式接種SPF 雞胚，第1代孵化雞胚于72 h內(nèi)死亡2枚，其余雞胚一直孵化至第6天，未有死亡。未死亡雞胚4 ℃凍存過(guò)夜后，取CAM進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAM增厚，有大小不等的白色、不透明痘斑出現(xiàn)，中間凹陷壞死。

2.3 ILTV的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 將分離ILTV出現(xiàn)痘斑病變的CAM的研磨液作為待測(cè)抗原，其和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清之間出現(xiàn)明顯的沉淀線，可以確診所分離的病毒為ILTV。

2.4 ILTV 的 PCR鑒定 采集有痘斑病變的雞胚絨毛尿囊膜提取DNA，進(jìn)行ILTV的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出530 bp的目的條帶(見(jiàn)圖1)，符合預(yù)期片段大小，可以確診所分離的病毒為ILTV。

圖1 有痘斑病變的雞胚絨毛尿囊膜的ILTV的PCR鑒定

3 討論

本試驗(yàn)采集該種雞場(chǎng)雞群疑似感染ILTV雞只的喉頭、氣管和肺等病料進(jìn)行病毒分離，經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜接種、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增對(duì)分離病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，所分離病毒為雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)。該雞群在疑似感染ILTV后，立即進(jìn)行ILT緊急免疫，未造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，死亡率為0.6‰(1萬(wàn)只雞死亡6只)。規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)ILT的防控主要以疫苗免疫接種為主，感染壓力小的地區(qū)種雞群一般在100日齡左右免疫1次可使雞群獲得終生的保護(hù)力，免疫方式以滴眼為主。該種雞群ILT發(fā)病周齡小，這在集約化養(yǎng)殖場(chǎng)中第1次發(fā)現(xiàn)，也為場(chǎng)區(qū)的生物安全防控敲響了警鐘。因此，在種雞群免疫ILT前應(yīng)加強(qiáng)場(chǎng)區(qū)的生物安全防控措施，包括場(chǎng)區(qū)的物資、車(chē)輛、人員的消毒管理以及雞舍通風(fēng)等方面，防止ILTV在種雞群免疫前侵入雞群。