呂氏泰勒蟲抗原蛋白PIP的表達及抗原性分析

楊 璐，王金花，趙建國，黃良圓，韓 謙，廖承紅

(1.海南大學生命科學與藥學院，海南 海口 570228；2.海南大學動物科技學院，海南 海口 570228)

呂氏泰勒蟲(Theilerialuwenshuni)是屬于頂器亞門(Apicomplexa)梨形蟲目，泰勒科(Theileriisae)的一種血液寄生原蟲，以蜱蟲作為傳播媒介，可引起動物感染泰勒蟲病。呂氏泰勒蟲主要感染山羊和綿羊等動物[1]，導致動物出現高熱、貧血、淋巴結腫大等癥狀，嚴重時可能導致動物的死亡，給畜牧業帶來了巨大的經濟損失[2]。目前我國發現的羊泰勒蟲病的病原主要有3種，尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、呂氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲(T.ovis)，雖然致病力依次減弱，但仍然存在潛在的暴發威脅[3-4]。所以迫切需要研究出能快速檢測診斷和預防該病的方法，以控制羊泰勒蟲病的傳染。

羊泰勒蟲病的診斷方法一般有血涂片染色鏡檢、分子生物學技術及血清學診斷等[5-7]。其中血清學檢測具有方便、快速、高效的優點，利于疾病的檢測和防控。ELISA是目前應用最多的血清學診斷方法。呂氏泰勒蟲的抗原蛋白，已報道的有裂殖子表面抗原P32[8]、呂氏泰勒蟲表面膜蛋白rTISP[2]，但rTISP蛋白需要在真核細胞中進行表達，抗原蛋白產率較低[9]，且其也可檢測尤氏泰勒蟲，不能特異性的檢測呂氏泰勒蟲，所以本研究以期找到一個可以在原核表達系統中大量表達的抗原蛋白用于呂氏泰勒蟲的檢測及診斷。PIP是呂氏泰勒蟲預測免疫蛋白[10]，目前并未見該蛋白表達及抗原性研究的相關報道。本研究將利用生物信息學軟件對其抗原性進行分析，以pTYB12質粒為載體，構建羊呂氏泰勒蟲原核表達質粒并表達，為呂氏泰勒蟲的血清學診斷及基因工程疫苗的制備提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量提取試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4 DNA Ligase、pMD18-T Vector Cloning Kit，均購自TaKaRa寶生物工程(大連)股份有限公司；FastDigestNdeI、FastDigestXhoI，均購自 Thermo Scientific公司；GreenTaqMix、DH5α Competent Cell，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；pTYB12表達載體，購自New England BioLabs公司；透析袋MD34，購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜，購自Milliproe公司；Rabbit Anti-Goat IgG H&L(Alexa Fluor?488)，購自Abcam公司。

1.2 基因組及血清 海南黑山羊抗凝全血、呂氏泰勒蟲陽性血清，均由海南大學病媒生物學實驗室制備及保存。

1.3 試驗方法

1.3.1PIP基因的生物信息學分析 利用生物信息學軟件GENSCAN(https://www.genes.mit.edu/GENSCAN.html)分析預測PIP基因中所含的外顯子和內含子的數目及位置，并用在線分析網站(http://www.detaibio.com/tools/index.php?r=signal-peptide%2Findex)對CDS區的信號肽的大小及位置進行分析。利用Protean軟件分析PIP蛋白預測該蛋白二級結構、表面可及性、可塑性及B/T淋巴細胞抗原表位等信息[11]，并且用IEDB Analysis Resourse(http://tools.iedb.org/main)預測PIP的抗原表位分布情況[12]，結果與Protean的結果對比后綜合判斷，為后續試驗研究該蛋白的抗原性提供理論依據。運用在線工具MyHits(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan)分析PIP蛋白結構域，TMpred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPREDform.html)在線軟件分析蛋白的跨膜區[13]，在線工具SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)預測蛋白的三級結構。ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)軟件預測PIP的理化性質。

1.3.2PIP基因引物合成及擴增 根據GenBank公布的呂氏泰勒蟲PIP基因CDS區序列(登錄號為EU753118.1)，利用Primer Premier 5.0軟件對PIP基因CDS區序列設計1對引物。并分別在上下游引物的5′端引入限制性內切酶NdeI和XhoI的酶切位點及其相應的保護堿基，序列如下，下劃線標記出了相應的酶切位點，上游引物為：PIP-NdeI-F:5′-CCAGGTTGTTGTACAGAATGCTGGTCATATGTTC-AAGGTCCTCGCCTTCTTTGCCTTTG-3′，下游引物為：PIP-XhoI-R:5′-CTGCAGTCACCCGGGCTCGAGTTAC-TTGAAGAACTTGAAGAGGGTAAGAGTGAAGAGGT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

提取羊全血DNA，以DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為50 μL：2×PapidTaqMaster Mix 25 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/mL)，DNA 2 μL，ddH2O 22 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 擴增30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環35次；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產物做核酸電泳檢測，并將目的條帶做膠回收，基因擴增片段大小預計為516 bp，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 pTYB12-PIP重組表達載體的構建及誘導表達 PCR產物與表達載體pTYB12進行雙酶切、連接、轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，振搖培養，提取重組質粒。經酶切測序鑒定，正確的重組表達質粒命名為pTYB12-PIP。

將陽性質粒pTYB12-PIP轉入BL21(DE3)感受態細胞，挑取陽性克隆振蕩培養，至OD600值為0.5左右時，加入誘導劑IPTG在37 ℃條件下進行誘導。誘導時間分別為0、2、4、6、18 h和24 h，IPTG的濃度為0.4 mmol/L和0.8 mmol/L，并用含有pTYB12空載的BL21(DE3)菌種37 ℃以0.4 mmol/L IPTG誘導6 h為對照組。通過SDS-PAGE電泳檢測，篩選最佳誘導表達時間和誘導劑濃度。以最佳誘導表達條件，大量表達重組蛋白CBP-PIP，超聲破碎提取總蛋白，離心收集上清和沉淀，做SDS-PAGE電泳分析觀察蛋白的表達情況。

1.5 PIP蛋白包涵體的變性與復性 由于該蛋白主要表達于包涵體中，將誘導表達的菌體破碎沉淀用變性緩沖液在4 ℃溶解變性，然后將溶液移置離心管中4 ℃，15 000g離心30 min。取上清加入MD34的透析袋中，以復性緩沖液 A、B、C、D及2次E的順序依次在4 ℃條件下透析，每次透析時間不少于3 h，使蛋白復性[14-15]，離心取上清，最后經SDS-PAGE電泳檢測上清中是否含有目的重組蛋白CBP-PIP。上述試劑配方見表1。

表1 蛋白包涵體的變性與復性緩沖液配方

1.6 Western Blot分析 以破碎后上清、沉淀及去除包涵體上清為樣品，經SDS-PAGE凝膠電泳后，在100 V、90 min條件下將蛋白轉置PVDF膜上，用超純水洗滌3次，在封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中室溫封閉2 h。1∶100稀釋血清(包括羊呂氏泰勒蟲陽性血清和陰性血清)4 ℃過夜孵育，TBST(含1%的Tween-20)洗滌3次。二抗為1∶5 000兔抗羊IgG H&L(Alexa Fluor?488)，孵育2 h。洗滌3次后利用掃膜儀通過熒光檢測，觀察結果。

2 結果

2.1PIP基因結構及抗原表位預測 根據GenBank中的呂氏泰勒蟲PIP基因的全長序列，在線預測其僅有1個外顯子，位于該基因序列668～1 183位，共516 bp，因此可用DNA作為模板以擴增其CDS區的序列用于蛋白的表達。CDS區的信號肽的大小及位置進行分析結果顯示1～17位氨基酸為信號肽。

用MyHits預測PIP的蛋白結構，顯示在18～41位 為His rich區，74～95位為亮氨酸拉鏈(LEUCINE ZIPPER)，在其兩端有2個肉豆蔻甲酰化位點位于71～76位和94～99位，另外在125～127有1個蛋白激酶C磷酸化位點位于125～127位氨基酸。軟件TMpred預測發現其有3個跨膜區，位于1～19位、88～110位、125～144位氨基酸。ExPASy ProtParam分析其理化性質，預測該蛋白為非溶性蛋白，等電點pI為9.04，分子質量為18.89 kDa。SWISS-MODEL同源建模的方法分析該蛋白全長空間結構，得到95～153位氨基酸預測結構(見中插彩版圖1)，由圖可知109～114位氨基酸為無規則卷曲，且位于蛋白結構表面，可變性強，是抗原表位的可能片段。

用IEDB Analysis Resourse預測B淋巴細胞表面抗原位于41～45位、68～75位和114位氨基酸(見中插彩版圖2)。DNASTAR中Protean的Jameson-wolf法預測B淋巴細胞的表面抗原主要位于40～48位、62～64位、67～75位、110～116位、122～129位、147～149位和151～158位。用Gamier-Robson法和Chouer-Robs法分析其二級結構，結果顯示主要為α螺旋占87.7%，有β折疊占26.9%，有9個β轉角分布均勻占21.1%，無規則卷曲有5個 位于69位、72～74位、83～84位、125～126位和129～133位。利用Karplus-Schul做可塑性分析，有8個可塑性較好的區域占20.4%。通過Emini做表面可及性分析，在124～125位、148～149位、153位氨基酸表面可及性較高，占2.9%。并且利用該軟件的AMPHI及Rothbard-Taylor法對T淋巴細胞抗原表位的分析結果預測PIP可能有8個T淋巴細胞抗原表位，分布于6～8位、31～41位、53～56位、63～68位、82～100位、125～129位、132～139位和145～157位(見中插彩版圖3)。

2.2PIP基因擴增 以呂氏泰勒蟲DNA為模板，用PIP基因CDS區的特異性引物進行PCR擴增。進行1%核酸凝膠電泳分析的結果顯示，得到1條500 bp左右的特異性擴增條帶，與預計PIP基因大小相符(圖4A)。

2.3 pTYB12-PIP重組表達載體的構建PIP基因PCR膠回收產物與表達載體pTYB12雙酶切連接，構建重組表達質粒。經雙酶切鑒定結果顯示，雙酶切獲得2個條帶，分別為載體片段和目的片段(圖4B)，表明pTYB12-PIP重組表達質粒的構建成功。

圖4 PIP基因的PCR擴增及pTYB12-PIP重組表達質粒雙酶切鑒定

2.4 PIP蛋白的誘導表達及純化 根據條件摸索選用37 ℃、0.4 mmol/L誘導表達6 h作為最佳表達條件(圖5)。通過超聲破碎裂解菌體后低溫高速離心，將上清與沉淀用SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結果表明該蛋白主要存在于沉淀中，是一種非可溶性蛋白。將沉淀用7 mol/L鹽酸胍變性后梯度透析復性，取上清做SDS-PAGE電泳檢測，結果顯示，在上清中純化得到較純的可溶性CBP-PIP重組蛋白(圖6A)。

圖5 重組蛋白CBP-PIP的SDS-PAGE電泳分析

2.5 Western Blot分析 以破碎后上清、沉淀及去除包涵體上清為抗原，進行Western Blot分析，結果表明破碎后上清、沉淀和去包涵體上清中的呂氏泰勒蟲PIP蛋白與呂氏泰勒蟲陽性血清反應，在68 kDa 左右處均有陽性條帶(圖6B)。

圖6 重組蛋白CBP-PIP純化結果及Western Blot分析

3 討論

抗原表位分析表明該蛋白具有一定的抗原性，因β折疊和α螺旋通常位于蛋白質內部且其結構規則緊密，一般作為蛋白骨架不具有抗原性，而β轉角和無規則卷曲一般位于蛋白表面，且具有較好的可塑性成為抗原表位的可能性比較大。同理，親水性好的區域更容易在蛋白表面，故有利于形成抗原表位[11,16-18]。另外，可塑性與表面可及性較好的區域柔韌性更好，利于抗原與抗體嵌合，有利于抗原表位的形成。綜合以上因素與Protean的Jameson-wolf法及IEDB Analysis Resourse生物信息學軟件[12]進行PIP蛋白B淋巴細胞抗原表位的分析，表明PIP具有較好的抗原性。SWISS-MODEL預測的蛋白空間結構時，由于數據庫中與PIP同源性片段較少，因此僅獲得PIP蛋白95～153位氨基酸空間結構的預測結果，其中109～114位氨基酸為無規則卷曲，可變性強，可以推測其成為抗原表位的可能性比較大，這與Protean的Jameson-wolf法的B淋巴細胞抗原表位的分析結果一致，增加了結果的可信度。

本研究成功獲得純化后的可溶性重組蛋白CBP-PIP。免疫原性分析結果顯示，表達的 PIP重組蛋白能被呂氏泰勒蟲感染羊的血清所識別，這說明該蛋白對呂氏泰勒蟲陽性血清有較好的抗原性。我們將對其他泰勒蟲和巴貝斯蟲種的陽性血清樣本進行檢測以確定其特異性，為下一步利用該蛋白對泰勒蟲病的早期、快速診斷提供理論支持。