Bartha K61株活疫苗對豬偽狂犬變異毒株和傳統毒株的免疫保護效力分析

嚴偉東，李 暢，于學祥，何啟蓋，楊漢春

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.華中農業大學動物醫學院，湖北 武漢 430070)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起豬和羊等多種家畜的一種急性傳染病[1]。其特征為發熱，奇癢及腦脊髓炎及可引起妊娠母豬繁殖障礙、流產、死胎和呼吸癥狀。新生仔豬除出現神經癥狀外還可侵害消化系統。豬是PRV的天然宿主、貯存者和傳染源。20世紀70 年代，我國從匈牙利引進了偽狂犬病活疫苗Bartha K61 株，使偽狂犬病得到了有效控制[2]。自2011年以來，豬偽狂犬病的流行在全國范圍內呈上升趨勢，目前已成為危害養豬業較為嚴重的疾病之一[3-5]。許多使用基因缺失活疫苗免疫的規?；i場依然出現了豬偽狂犬病暴發。有研究表明，PRV流行變異毒株的毒力增強，抗原位點發生突變[6-9]。

PRV的基因組為雙股線性DNA，約150 kb，可編碼70～100種蛋白質[2]。其中糖蛋白gB、gC和gD是PRV最主要的保護性抗原，能刺激動物產生中和抗體和病毒特異性的細胞免疫應答反應。研究表明，分離的PRV變異新毒株一方面其gE和gI毒力基因上發生多個位點插入或基因點突變導致毒力增強；另一方面流行變異毒株的gB、gC和gD主要免疫基因與以前毒株相比發生了基因的插入或缺失以及點突變，導致產生中和抗體位點發生突變[10-14]。我們前期從河北某大型養豬場免疫偽狂犬病活疫苗Bartha K61株發病流產胎兒腦組織病料分離到變異新毒株PRV-XT，對仔豬呈現高毒力。本研究采用豬偽狂犬病活疫苗Bartha K61株免疫PRV抗體和抗原雙陰性仔豬，通過免疫攻毒保護試驗評價Bartha K61株對變異新毒株PRV-XT的預防效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗與毒株 PRV Bartha K61弱毒活疫苗，購自某國際知名生物制品公司；PRV-XT變異新毒株和PRV 傳統毒株EA由本實驗室保存。PK-15細胞由本實驗室保存。

1.1.2 試驗動物 4～5周齡杜長大三元商品仔豬(IDEXX試劑盒檢測PRV gB和gE抗體雙陰性)，PCR和RT-PCR檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)抗原陰性，購自湖北某散養豬戶，該豬場沒有接種豬偽狂犬疫苗，28日齡斷奶。

1.2 方法

1.2.1 病毒擴增以及毒價測定 分別將PRV-XT和EA株病毒，接種于長滿的單層PK-15細胞，置37 ℃ 溫箱培養孵育1 h后，換成1% DMEM維持液并每日觀察細胞病變，當病變70%～80%時，收獲病毒，-70 ℃保存備用。分別取培養好的病毒，經10倍系列稀釋，取100 μL接種到長滿單層PK-15的96孔細胞培養板，設8個重復，每天觀察細胞病變，記錄病變孔數，按照Reed-Muench法計算半數細胞感染量(TCID50)。

1.2.2 仔豬免疫分組及攻毒試驗 5周齡PRV gB和gE抗體雙陰性健康仔豬20頭隨機分成4組，每組5頭仔豬。A 組:Bartha K61 疫苗每頭豬注射1頭份，免疫后28 d攻毒，每頭豬滴鼻接種PRV-XT株1 mL(107TCID50)；B 組:Bartha K61 疫苗每頭豬注射1頭份，免疫后28 d攻毒，每頭豬滴鼻接種PRV-EA株1 mL(107TCID50)；C 組:陰性對照組，肌內注射PBS 2 mL/頭，每頭豬滴鼻接種PRV-XT株1 mL(107TCID50)；D 組:陰性對照組，肌內注射PBS 2 mL/頭，每頭豬滴鼻接種PRV-EA株1 mL(107TCID50)。攻毒后觀察14 d，記錄體溫及臨床癥狀和死亡情況，評價Bartha K61疫苗對新型變異毒株PRV-XT株的保護效果。攻毒2周后將所有豬全部撲殺，觀察病理學變化。

1.2.3 偽狂犬病gB和gE抗體檢測 疫苗免疫前和免疫后每隔14 d對試驗豬進行前腔靜脈采血，并分離血清，一部分血清用于PRV ELISA抗體檢測，剩余的血清-20 ℃保存用于中和抗體檢測。血清中gB和gE抗體均采用商品化的美國IDEXX公司PRV gB和PRV gE ELISA阻斷抗體檢測試劑盒進行檢測，均按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 中和抗體效價測定 按固定病毒-稀釋血清法進行中和試驗。先將免疫前血清和免疫后14 d和28 d血清，以及攻毒后14 d血清經56 ℃水浴滅活30 min后進行2倍倍比系列稀釋，分別取不同稀釋度血清與200 TCID50PRV病毒(PRV-XT 或EA毒株)1∶1混合，于37 ℃作用1 h，每個稀釋度接種4孔PK-15單層細胞，同時設正常細胞陰性對照和不同毒株病毒的陽性對照。置5%CO2培養箱37 ℃培養，每天觀察并記錄細胞病變情況，連續觀察5 d，按Reed-Muench法分別計算血清的中和抗體滴度。

1.2.5 攻毒后鼻腔排毒檢測 攻毒后每隔2 d采集口咽棉拭子并置于DMEM培養液中，凍融處理后接種PK-15細胞進行TCID50測定。

1.2.6 攻毒后相對體重檢測 攻毒前及攻毒后2周分別對每頭豬進行體重測定，計算攻毒結束后免疫各組豬的體重變化情況。

1.2.7 病理學檢測 剖檢后制作所有試驗豬的腦部組織病理切片，使用蘇木紅-伊紅染色(H.E.染色)，觀察病理變化情況。

2 結果

2.1 PRV gB和gE抗體檢測 所有仔豬在免疫前gB和gE抗體均為陰性，免疫14 d和28 d的血清以及攻毒后14 d血清進行抗體檢測。試驗結果顯示，PRV gB抗體隨著時間的推移不斷升高，在攻毒后14 d抗體水平最高(見圖1 A)。在攻毒前，所有免疫組豬的gE抗體均為陰性，攻毒后14 d所有攻毒豬gE抗體均為陽性(見圖1 B)。

圖1 Bartha-K61 疫苗免疫后仔豬 PRV抗體檢測

2.2 中和抗體 所有試驗豬在攻毒前均檢測不到相應的中和抗體，攻毒結束后可檢測到PRV中和抗體，這表明是攻毒而產生的特異性中和抗體。免疫組在免疫后14 d和28 d均能檢測到中和抗體，與gB抗體趨勢一致，隨著時間推移抗體水平逐步提高。Bartha K61弱毒活疫苗免疫豬血清抗PRV-EA毒株中和抗體明顯高于抗PRV-XT毒株，兩者之間差異顯著(P<0.05)。見圖2。

圖2 Bartha K61 疫苗免疫后仔豬 PRV中和抗體檢測

2.3 免疫攻毒后對豬體重影響 非免疫陰性對照組仔豬在PRV-EA株和變異株PRV-XT株攻毒后，均出現嚴重的體重下降。但是在免疫組中，PRV-EA攻毒組體重沒有下降，且攻毒結束后，每頭豬體重均有了明顯的增長，顯著高于非免疫攻毒對照組。PRV-XT 攻毒組個別豬體重出現下降，但整體體重有增長，顯著高于非免疫攻毒對照組；而且PRV-EA 攻毒組體重比較差異顯著(P<0.05)。見圖3。

圖3 仔豬攻毒后各組仔豬的相對平均日增重

2.4 攻毒后臨床癥狀及病理變化 疫苗免疫PRV-EA攻毒組沒有觀察到明顯的臨床癥狀，僅出現一過性體溫升高。疫苗免疫PRV-XT攻毒組出現體溫升高，且持續多日。攻毒后3～5 d食欲下降，并在試驗第9天時豬只死亡1頭，試驗結束死亡率為20%(見封二彩版圖4)。未免疫攻毒組均出現了體溫升高、精神沉郁和食欲下降的臨床癥狀，其中未免疫PRV-XT攻毒組臨床癥狀最為明顯，豬只出現典型神經癥狀(共濟失調)和打噴嚏癥狀，并在10 d內全部死亡(見圖5)，未免疫PRV-EA攻毒組攻毒后也出現較為嚴重的臨床癥狀，且在試驗第4天時死亡1頭，試驗結束時共3頭豬只死亡。臨床剖檢結果發現，未免疫攻毒組死亡豬有明顯可見的病理變化，如扁桃體潰瘍和壞死灶、腦膜充血、肺臟局部充血等病變。疫苗免疫PRV-XT攻毒組2頭豬出現腦膜充血。疫苗免疫PRV-EA攻毒組均未見肉眼可見病變。剖檢后制作所有試驗豬的腦部組織病理切片，結果與大體病理變化保持一致。疫苗免疫變異株PRV-XT攻毒組有2頭豬腦組織出現腦實質內淤血現象(見封二彩版圖6 A)，未免疫PRV-XT攻毒組和未免疫PRV-EA攻毒組豬腦組織腦膜下和腦實質內也出現淤血現象(見封二彩版圖6 C，6 D)。

圖5 仔豬攻毒后各組仔豬的存活率

2.5 攻毒后豬排毒檢測 攻毒后采集仔豬鼻腔鼻拭子通過測定毒價檢測攻毒后試驗豬的排毒情況。試驗結果顯示，所有攻毒豬均有排毒,均在攻毒后第2天開始排毒，在第4天達到排毒高峰，其中PRV-EA免疫攻毒組在第8天后沒有檢測到排毒，但PRV-XT免疫攻毒組排毒持續到第10天，兩組陰性對照組排毒期均持續到試驗結束。其中空白組攻毒PRV-XT后，第4天排毒量達到所有組別最高值(104.75/mL)(見圖7)，且均值高于PRV-EA 攻毒組，兩者之間差異顯著(P<0.05)。

圖7 攻毒后各組仔豬鼻拭子排毒的檢測

3 討論

自2011 年以來，我國暴發的豬偽狂犬病疫情主要是PRV野毒發生抗原變異和毒力增強引起的[1]。遺傳進化表明，PRV變異毒株與經典的PRV 毒株主要免疫基因gB差異明顯，處于不同的分支。變異毒株屬于基因II 型，而經典株屬于基因I 型[9]。流行病學結果調查顯示，PR在Bartha K61弱毒活疫苗免疫的豬場疫情暴發較為嚴重。而在Bartha K61弱毒活疫苗免疫的豬場暴發的疫情最嚴重，這一現象暗示經典Bartha K61弱毒活疫苗不能對當前流行的變異毒株提供良好的免疫保護[2,4,8,13,15]。變異毒株多是從免疫Bartha K61株弱毒疫苗的豬場分離，表明在臨床上該疫苗不能提供完全的保護，需要根據流行優勢毒株研制新的基因工程疫苗[2,13]。但在臨床上也有部分豬場免疫Bartha K61弱毒活疫苗通過增加免疫次數和提高接種提高保護效果。

國內多個實驗室分離變異毒株，并構建了多個基因缺失疫苗候選毒株。在這些候選疫苗免疫保護試驗中，由于免疫仔豬日齡、免疫期、免疫劑量、攻毒劑量和攻毒途徑等不同，試驗結果也有差異[2,7,13]?？傮w上都能抵抗變異強毒株的攻擊，但都不能阻止排毒現象的發生，只能降低排毒天數和降低排毒量。

本試驗根據臨床上Bartha K61弱毒活疫苗使用現狀，免疫PRV陰性仔豬28 d后，再用經典強毒株和流行變異強毒株進行攻毒。結果表明，Bartha K61弱毒活疫苗能完全抵抗傳統毒株PRV-EA株的攻擊，只有輕微一過性體溫變化，無臨床癥狀，不影響體重的增長，攻毒14 d后剖檢，肺部和腦部無明顯病理變化。而Bartha K61弱毒活疫苗免疫仔豬使用流行變異強毒株PRV-XT株攻毒，仔豬攻毒后體溫持續高熱，41 ℃持續3 d，體重明顯下降，且豬只有死亡現象，攻毒結束剖檢個別仔豬腦部出現明顯出血現象。攻毒后仔豬鼻腔能檢測到排毒現象，且持續多日，這對當前PR流行變異毒株的防控很不利。

豬偽狂犬病弱毒疫苗不僅誘導高水平的細胞免疫反應，而且能誘導產生良好的中和抗體。但滅活疫苗誘導更高水平的中和抗體。合理地聯合使用豬偽狂犬病弱毒疫苗和滅活疫苗可以產生良好的防控效果。本試驗表明，Bartha K61株疫苗能對經典PRV-EA毒株提供良好的免疫保護,但對流行的變異株PRV-XT株僅能提供部分保護。因此，在Bartha K61株疫苗免疫基礎上聯合免疫滅活疫苗是防控我國豬偽狂犬病的有效措施。此種聯合免疫策略與gE 抗體檢測試劑盒配套使用，在臨床上剔除野毒感染豬群，為我國豬偽狂犬病的凈化和根除提供保障。

4 結論

傳統的Bartha K61株疫苗能對經典PRV-EA毒株提供良好的免疫保護,但對流行的變異株PRV-XT株僅能提供部分保護。攻毒結果證實，該疫苗不能完全阻止PRV強毒株的排毒。流行變異毒株攻毒后，免疫仔豬體溫升高現象且持續多日，且有豬只死亡發生。