我國牛羊藍舌病血清學調查

朱 沛，肖 雷，苗海生，楊振興，謝佳芮，朱建波，李華春

(云南省畜牧獸醫科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室 , 云南 昆明 650224)

藍舌病(Bluetongue,BT)是由藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的綿羊和其他家養及野生反芻動物的一種非接觸性烈性傳染病[1]。該病能引起發熱、白細胞減少、發紺、鼻腔和胃腸道黏膜嚴重的卡他性炎癥，并能引發妊娠母畜流產、死胎等，對養殖業造成重大損失[2]。該病致死率為20%～30%，有時甚至高達90%[3]，由于BT對畜牧業和畜產品經濟貿易的影響以及對社會經濟大環境的潛在威脅，世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health,OIE)將藍舌病列為法定上報的疫病，我國將其列為一類傳染病[4-5]。

藍舌病病毒為雙鏈RNA病毒，屬于呼腸孤類病毒科環狀病毒屬，它分布于全球大多數熱帶地區，并且分布范圍不斷擴大，散發于亞熱帶、溫帶地區，成為了世界性的傳染病[6-7]，目前全球已經發現的BTV共有27個血清型[8-10]。中國于1979年首次分離到BTV，目前已在我國的29 個省份檢測到感染BTV的病畜[11]，并已鑒定出7個血清型(BTV1、2、3、4、12、15、16)[12]，其中BTV1和BTV16為優勢血清型[13]。雖然藍舌病還未在我國暴發過，但我國地域遼闊，氣候環境多樣，適合蟲媒病毒媒介生存繁殖的地域也很多，目前已發現絕大多數地區都存在該病毒的感染，且目前暫未出現能有效預防藍舌病的疫苗，由此可見，我國發生該病的風險很大，開展大規模藍舌病血清學調查研究尤為迫切。本試驗采用BTV競爭酶聯免疫吸附法(C-ELISA)對2015-2017年我國重慶、新疆、西藏、湖北、河北、廣西、貴州、內蒙古、吉林、遼寧、四川、云南共12個省區的19 237份血清進行檢測，其結果將為我國藍舌病的風險防控提供重要依據和參考[14]。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 血清樣品(n=19 237)由各省市(地區)的動物防疫控制中心采集，常規分離，-20 ℃保存；BTV C-ELISA檢測試劑盒，由云南省畜牧獸醫科學院熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供；BioTek ELX-800酶標儀；AquaMax 2000洗板機，購自Molecular Devices公司。

1.2 血清BTV C-ELISA檢測 用本實驗室建立的BTV C-ELISA試劑盒檢測中國12個省62個地區的血清抗體水平，共計19 237份樣品，取試劑盒提供的ELISA板，每孔分別加入10 μL的待檢血清和陽性、弱陽性、陰性對照血清，每份樣品設2孔平行，置37 ℃溫育30 min后，用試劑盒提供的樣品稀釋液按照1∶100倍稀釋兔抗BTV抗體，每孔加50 μL，37 ℃ 溫箱里溫育60 min后，用PBST洗液洗板2次，拍干，按1∶1 000倍稀釋羊抗兔IgG-HRP酶標抗體，每孔加50 μL；37 ℃溫箱里溫育30 min后，用PBST洗液洗板5次，拍干，每孔加入50 μL底物反應液，37 ℃避光溫育10 min后，每孔加入終止液50 μL終止反應，15 min內在酶標儀450 nm波長下讀取OD值。

1.3 結果判定 當2個陽性對照孔OD450≤0.2，2個孔間OD450 nm差距小于0.05，且2個陰性對照孔1.0≤OD450<1.6，2個孔間OD450差距小于0.2時，表明試驗成立，根據公式計算抑制率(PI)=(陰性對照OD450平均值-樣品血清OD450)/陰性對照OD450平均值×100%，當抑制率≥50%時判為抗體陽性，否則為陰性。

2 結果

2.1 BTV血清學調查 12個省區的BTV抗體平均陽性率見表1，結果表明，被調查地區的BTV血清陽性率呈現明顯地域特征，具體表現為低緯度地區普遍高于高緯度地區，植被豐富地區高于同緯度的其他地區。試驗結果顯示，BTV陽性率最高的3個省為廣西、重慶和云南，平均陽性率分別為38.14%、24.59%和23.34%，BTV陽性率最低的3個省為遼寧、吉林、河北，平均陽性率分別為4.33%、8.63%和9.87%，而緯度相近的內蒙古地區BTV平均陽性率(10.88%)遠高于旁省，說明了茂盛的植被與草場也是影響蟲媒病毒傳播的重要因素，另外，高海拔的西藏地區，BTV陽性率高達22.39%，可能的原因是被調查地區大多位于西藏東南地區的雅魯藏布江谷地，當地氣候溫暖濕潤，為BTV的媒介傳播創造了有利條件，致使當地牛、羊的BTV血清陽性率升高。

表1 我國部分省份牛羊血清樣品及檢測結果

2.2 不同動物BTV的感染率 本試驗對6個省份同一地區在同一時間采集的牛、羊血清進行檢測，來比較不同動物BTV的血清陽性率，結果表明(見表2)，除云南省外(牛42.3%、羊28.7%)，所有地區的羊血清陽性率(16.7%～62.6%)均高于牛(0～28.4%)；通過比較內蒙古、新疆的綿羊和山羊的血清陽性率，可以得出2個地區綿羊血清的陽性率(36.0%、37.1%)均高于山羊(16.7%、24.1%)，綜上，BTV的易感程度綿羊>山羊>牛。

表2 不同動物BTV抗體陽性率比較

2.3 不同季節BTV的感染率 本試驗對云南省德宏、曲靖和普洱這3個地區不同季節采集的牛、羊血清進行檢測，結果顯示，牛、羊血清的BTV陽性率具有明顯的季節性(表3)，其中以第1季度(1～3月)平均陽性率最低，牛血清為0～13.3%，羊血清為6.7%～13.3%；第3季度(7～9月)平均陽性率最高，牛血清為38.3%～41.7%，羊血清為23.3%～46.7%；由于夏季濕熱的氣候利于蟲媒的繁殖和活動，導致血清陽性率在第2季度(4～6月)逐漸升高，其中牛血清第2季度(4～6月)BTV平均陽性率27.8%～28.9%，羊血清為15.6%～31.1%，到第3季度牛羊血清陽性率均達到最高值，到第4季度(10～12月)由于冬季氣溫低，蟲媒活動不頻繁，陽性率也隨之降低，其中牛血清平均陽性率為10.0%～16.7%，羊血清11.7%～20.0%。綜上，BTV牛羊血清陽性率第3季度>第2季度>第4季度>第1季度。

表3 不同季節BTV抗體陽性率比較

3 討論

藍舌病作為蟲媒病毒[15]，傳播媒介和儲存宿主較多，一種媒介又可以傳播多種病毒，增大蟲媒病毒的防控難度，且目前沒有有效的預防措施和治療方法，主要通過撲殺帶毒動物及防治蟲媒來阻止病毒的傳播；我國幅員遼闊，自然環境復雜，蟲媒病毒傳播媒介種類多，分布廣，危害嚴重，因此，系統地調查BTV在我國的血清學流行情況任務迫切。

本試驗選取了在氣候海拔等方面都極具代表性的12個省62個地區作為調查對象，從 2015-2017年的試驗結果顯示，被調查的12個省份均存在BTV的流行。

蟲媒病毒的流行性主要取決于蟲媒的活動情況[16]，極易受外界環境中溫度、濕度、海拔等因素影響，因此具有明顯的地域性和季節性。有研究表明，藍舌病主要存在于南緯35°到北緯40°的地區，本試驗調查的地區幾乎都在這個緯度區間內，解釋了被調查的地區均存在BTV感染的現象。

本試驗調查的12個省(區、市)中，BTV抗體陽性率最低的3個地區是遼寧、吉林和河北，BTV年平均陽性率分別為4.33%、8.63%和9.87%，可能的原因是高緯度高寒地區不利于蟲媒的生存和繁殖，導致了BTV陽性率遠低于其他地區，而相同緯度的內蒙古自治區BTV年平均陽性率略高(10.88%)的可能原因是草場茂盛，而草地適宜的氣候和濕度為蟲媒的生長和繁殖創造了條件，導致其陽性率升高；而長江以南的大部分地區因為適宜的海拔和氣候條件使得BTV在當地盛行，其中陽性率最高的3個地區為廣西、重慶、云南，BTV年平均陽性率分別為38.14%、24.59%、23.34%，遠高于全國年平均水平；值得注意的是，西藏作為高海拔高寒地區，BTV年平均陽性率也高達22.39%，可能的原因是染病動物通過貿易被帶到西藏地區，也可能是庫蠓適應能力增強，變異出適應高海拔、高寒環境的品種[17]，并且本試驗調查的拉薩及日喀則地區位于雅魯藏布江谷地，氣候溫暖濕潤，地勢較低，屬于熱帶山地氣候，適合蟲媒生長，為BTV傳播創造了條件。

本試驗通過對云南省德宏、曲靖、普洱三地不同季度采集的牛羊血清的檢測發現，山羊對BTV的感染率低于牛，與其他調查地區的結果相悖，可能的原因有幾個，首先云嶺牛的皮膚表面積大，被毛短，叮咬面積遠大于山羊，增大了BTV感染的可能；其次云南省肉牛養殖量大，蟲媒通過長期叮咬牛已經變異出適應牛的品種，所以偏好于叮咬牛；另外云南的云嶺山羊品種不同于成都的麻羊、貴州白山羊等，也可能導致了BTV感染率上的差異。本試驗還發現BTV的流行具有明顯季節性，牛羊血清陽性率在第2季度(4～6月)逐漸升高，到第3季度(7～9月)達到頂峰，又在第4季度(10～12月)逐漸降低，以第1季度(1～3月)牛羊血清陽性率最低。由于BTV是蟲媒病毒，它的傳播依賴媒介，所以感染率與蟲媒活動密切相關，夏季天氣炎熱濕度又大，蟲媒活動頻繁，所以BTV陽性率在夏季逐漸升高，到秋季到達頂峰，隨著入冬氣溫下降陽性率又逐漸降低，到第1季度BTV血清陽性率呈現最低，呈明顯季節性。

本試驗通過對2015-2017年全國12個省62個地區共計19 237份血清樣品的調查研究，明確了藍舌病在被調查的地區均有流行，同時發現在中國西藏等高海拔寒冷地區，有藍舌病病毒和傳播媒介存在，值得進一步深入研究。本試驗調查范圍廣，樣本數量多，為了解中國各地區BTV的流行情況提供了血清學佐證，也為準確評估藍舌病在我國的危害以及制定有效防治措施提供了可靠依據。