1株鴿源基因Ⅶ型新城疫強毒株的分離鑒定及全基因組分析

李夢嬌，栗永華，楊 彬，徐智凱，王漢青，仇旭升，孫英杰，譚 磊，廖 瑛，宋翠萍，劉煒煒，丁 鏟，孟春春，吳艷濤

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 閔行 200241)

新城疫(Newcastle disease，ND)是嚴重危害養禽業的病毒性傳染病，其宿主范圍非常廣泛，可以感染家禽、水禽和多種鳥類。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科，禽Avulavirus-1型，分別編碼3′-NP-P-M-F-HN-L-5′六種主要的結構蛋白[1]。目前NDV可以分為Class I和Class II 兩大分支，ND自1926年暴發以來，共有四次大流行。其中第三次大流行主要是由鴿感染新城疫病毒引起，大多數鴿源NDV屬于基因VI型，特別是被稱為PPMV-1的VIb亞型[2-3]。

分子流行病學結果顯示，自20世紀90年代以來，危害我國家禽的NDV強毒主要為基因Ⅶ型[4]，且該型病毒在雞、水禽均有大量分離，但從鴿群中分離出基因Ⅶ型NDV卻少有報道[5]。2016年11月-2017年3月，上海嘉定地區發生了數起鴿感染NDV疑似病例，病鴿表現為精神沉郁，食欲下降，拉稀。隨后從發病的鴿群中采集泄殖腔棉拭子接種SPF雞胚進行病原的分離，通過血凝和血凝抑制試驗從中鑒定出1株鴿源新城疫病毒(NDV)，并將其命名為Pigeon/China/SHJD13/2017。初步鑒定后該病毒屬于基因Ⅶ型，為了更好地解析NDV的跨種間傳播規律，本試驗對此鴿源基因Ⅶ型NDV進行了3次噬斑純化后測定其全基因組序列，著重比較了毒力基因的點突變規律；還通過雞胚平均死亡時間(MDT)、腦內致病指數(ICPI)等指標的測定對其毒力進行了系統的評價，以期為ND的防控提供更好的理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒 鴿源新城疫病毒Pigeon/China/SHJD13/2017，分離自上海嘉定發病鴿群。對發病的鴿群采集泄殖腔棉拭子接種SPF雞胚進行病原的分離，經3次噬斑純化后用于后續病毒的全基因組序列測定以及生物學特性分析。

1.2 SPF雞胚以及SPF雞 SPF雞胚，購自北京梅里亞動物保健有限公司;1日齡SPF雛雞由本實驗室自行孵化。

1.3 分子生物學試劑 TRIzol LS Reagent試劑，購自Life Technologies Corporation公司；反轉錄酶AMV、5×AMV Buffer、dNTPs、RNA酶抑制劑(PRI)、pMD19-T載體，均購自寶生物工程(大連)有限公司；ExTaq聚合酶，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Promega公司；DH5α感受態細胞，購自天根生化科技(北京)有限公司；綠如藍核酸染料(UV型)，購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.4 病毒RNA的提取與反轉錄 參照TRIzol法使用說明書進行病毒抽提，按照如下體系進行配制：AMV 1.5 μL，5×AMV Buffer 10 μL，dNTPs 2 μL，PRI 1 μL，將上述14.5 μL體系與33.5 μL RNA和2 μL 6 nt引物充分混勻后，于42 ℃水浴2 h，75 ℃水浴5 min，將病毒反轉錄成cDNA后保存于-20 ℃備用。

1.5 全基因的擴增與克隆

1.5.1 引物合成 參考GenBank公布的NDV全基因組序列(主要參考ZJ1、SF2等毒株的核苷酸序列)，共設計了11對引物，相鄰擴增片段之間有100 bp 左右的重疊序列，引物覆蓋NDV的整個基因組。所設計的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成，引物序列見表1。

表1 NDV全基因組擴增的PCR引物表

1.5.2 Pigeon/China/SHJD13/2017各基因的擴增 采用50 μL的PCR反應體系：10 μmol/L上下游引物各2 μL，PCR Mix 25 μL，cDNA 2 μL，滅菌超純水補足至50 μL。PCR反應程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55～60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 5 min。

1.5.3 Pigeon/China/SHJD13/2017全基因片段的克隆轉化 將上述PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，按照DNA凝膠回收試劑盒操作說明書純化回收瓊脂糖凝膠。按pMD19-T載體說明書加入連接體系，將上述連接產物轉化入DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌落，經菌液PCR鑒定陽性者送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.6 測序結果的拼接和比較分析 利用DNASTAR、MEGA等軟件對測序結果進行比對拼接分析，并繪制其進化樹。

1.7 Pigeon/China/SHJD13/2017病毒MDT、EID50以及1日齡雛雞ICPI的測定 按照參考文獻[6]，測定Pigeon/China/SHJD13/2017分離株的雞胚半數感染量(EID50)、雞胚最小致死量平均死亡時間(Mean death time,MDT)，同時進行1日齡雛雞腦內接種致病指數(Intracerebral pathogenicity index in day-old chickens,ICPI)的測定。

2 結果

2.1 Pigeon/China/SHJD13/2017病毒的噬斑純化 病毒做10-5稀釋時可以產生明顯空斑，挑取純化后的噬斑加入800 μL維持液中，將其作為第2輪病毒純化的母液，再次接種DF-1細胞后進行純化，采取相同的方法共純化3次。

2.2 病毒毒力測定 Pigeon/China/SHJD13/2017病毒毒力測定結果顯示，分離株EID50為10-8/mL、MDT為57.2 h(<60 h)、ICPI為2(>1.6)，其MDT和ICPI結果均符合NDV強毒株的毒力指標。

2.3 全基因序列比較 用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，如圖1所示，結果所設計的11對引物均能擴增出清晰的目的條帶，且條帶大小與預期結果相符。

圖1 NDV Pigeon/China/SHJD13/2017分離株全基因RT-PCR結果

2.4 NDV Pigeon/China/SHJD13/2017分離株全基因組結果分析 測序后，用DNASTAR軟件進行拼接，鑒于NDV末端序列高度保守的特性，本試驗沒有進行RACE試驗測定病毒3′和5′基因組末端序列，其基因組全長15 192 bp。將分離株基因的核苷酸序列與其他NDV參考株相對應的核苷酸序列進行比較，結果如圖2所示。從進化樹中可以看出，分離株與Chicken/China/SDWF07/2011、Chicken/China/Shandong/02/2012這2株雞源Ⅶ NDV同源性高達99.9%，與GenBank上已發表的鴿源Ⅶ NDV 毒株的同源性也均在99%以上。

圖2 40株NDV毒株全基因編碼核苷酸序列的遺傳進化樹

分離株F蛋白裂解位點的氨基酸殘基為112R-R-Q-K-R-F117，符合NDV強毒株的分子特征，參照Lomniczi B等[7]的分析方法，Pigeon/China/SHJD13/2017分離毒株F蛋白的101位氨基酸為K，121位氨基酸為V，是基因Ⅶ型NDV的分型特征。其F蛋白抗原決定簇、潛在糖基化位點以及13個半胱氨酸殘基位點均高度保守，與當前分離出的鴿源Ⅶ毒株相比，其F基因僅在78位以及231位氨基酸位點處表現出了特異性，具體結果見表2。

表2 分離株F、HN蛋白關鍵氨基酸位點與鴿源VII、雞源VII毒株之間的比較

HN基因遺傳進化分析結果顯示，分離株HN共編碼571 aa，符合NDV強毒的特征，該分離株含有13個半胱氨酸殘基，6個潛在的糖基化位點，且高度保守。與當前分離出的鴿源Ⅶ毒株相比，其HN基因僅在36、49、102、120等位點上表現出一定的特異性。

3 討論

鴿新城疫是由新城疫病毒感染引起的臨床上以腹瀉和神經癥狀為主的一種急性、敗血性、高度接觸性鴿類傳染病，其臨床表現與雞新城疫相似，對養鴿業危害嚴重[8]。其中，引發第三次大流行的鴿源新城疫病毒于20世紀60年代在德國被發現，死亡率達到50%[9]。20世紀70年代傳至中東地區，死亡率可達80%。1985年該病傳至我國香港，隨后鴿源新城疫病毒傳至我國各地，成為威脅我國養鴿業的一種主要疾病[10]。

在分子生物學大規模應用前，NDV的分類主要采用單抗排譜法，Alexander D J等將鴿源NDV命名為P群[11]。隨后，Dorina等通過對68株NDV進行遺傳進化分析，將鴿源NDV歸于Ⅵb亞型[12]。而Ⅵb亞型又分為Ⅵb1和Ⅵb2兩個分支，其中大部分毒株屬于Ⅵb1分支。劉秀梵等對我國1985-2011年的新城疫病毒進行了基于F基因47～420位核苷酸的遺傳進化分析及限制性酶切分析，將基因Ⅵ型NDV劃分為Ⅵa-Ⅵg七個亞型，其中鴿源毒株被歸為基因Ⅵb亞型，我國2000年后所報道的鴿源NDV分離株基本屬于這一分支[13]。

自20世紀90年代基因Ⅶ型NDV成為世界優勢毒株以來，其宿主范圍有不斷擴大趨勢。目前該型毒株在雞、火雞、鴨、鵝和觀賞禽類中均有分布[14]。但在鴿群中的分布報道依然比較少見。吳雙等用基因Ⅶ型NDV強毒株感染鴿子后，發現其能造成攻毒鴿100%的死亡，而且感染鴿的發病程度與死亡率明顯高于傳統的Ⅵb亞型毒株[15]。黎俊君等從廣東分離的4株鴿源NDV有1株為Ⅶ型，2株為Ⅵ型，1株屬于Ⅱ型[15-16]。隨后何琴等也從鴿體內分離到1株基因Ⅶ強毒株，系統進化樹表明該毒株與廣西鴿源株Gxp40處于同一系分支，同源性最近[17]。雖然目前基因Ⅶ型NDV毒株在鴿子體內只是偶有分離，但鴿群感染Ⅶ型毒株并造成發病和流行的風險依然存在。

本試驗分離出的NDV從生物學特性上來看，是1株鴿源基因Ⅶ型新城疫強毒，關于其對鴿的致病性，有待進一步進行動物試驗確認。通過全基因組測序，以及對分離株各基因的起始、終止位置和基因間隔位置進行統計，其與Ⅶ 型毒株的序列基本相同。利用MEGA軟件繪制進化樹確定其與雞源基因Ⅶ 型新城疫強毒親緣關系較近。對F基因進行同源性分析，結果表明，分離株與Chicken/China/SDWF07/2011、Chicken/China/Shandong/02/2012這2株雞源Ⅶ NDV同源性高達99.9%，與GenBank上已發表的鴿源Ⅶ NDV 毒株的同源性也均在99%以上。相關研究顯示，基因Ⅶ型NDV可以在鴿子和雞之間進行相互傳播[15]，這揭示了該分離株可能來自于感染的雞群。此外，該分離株的MDT、EID50、ICPI測定結果也均符合NDV強毒株的分子特征。與當前分離出的鴿源Ⅶ 毒株相比，F基因在78位以及231位氨基酸位點處表現出了特異性。而HN基因在36、49、102、120等位點處氨基酸殘基與部分雞源Ⅶ毒株編碼的氨基酸序列一致，這進一步揭示了本試驗的鴿源分離株可能來源于感染的雞群。相比較NDV的其他宿主，鴿活動范圍較大，若攜帶強毒株NDV進行擴散，則有可能導致新一輪新城疫的大流行，因此，了解鴿源NDV的遺傳演化規律及其流行病學情況，對于新城疫的臨床診斷和防控具有重要的指導意義。