阿司匹林抗腫瘤研究進展

嚴晨強 綜述 黃 河 審校

阿司匹林(aspirin，acetylsalicylic acid，ASA)化學名為乙酰水楊酸，是非甾體類抗炎藥，現已被廣泛使用。1852年蒙彼利埃大學化學教授Charles Gerhart 發現了水楊酸分子結構，利用水楊酸與醋酐進行了合成，由于其純度低且不穩定未能引起重視[1]。1897年，Felix Hoffmann首次合成了ASA并純化[2]。1899年Felix Hoffman合成的乙酰水楊酸被注冊為“Aspirin”并開始用于臨床[1]。我國于1958年開始生產。隨著研究的逐漸深入， ASA被廣泛用于鎮痛、抗炎、退熱、心血管疾病、內分泌疾病、腫瘤領域等。ASA與腫瘤的關系已有較多研究，葉華等[3]的一項Meta分析表明，結直腸癌患者長期口服小劑量ASA可能有助于改善預后。長期服用可導致消化道不良反應，但長期隔日服用不僅能減少不良反應，還使其抗腫瘤的凈效益增加[4]。食管癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、和肺癌等腫瘤中都發現了ASA的抗腫瘤作用[5,6]。筆者對ASA抗腫瘤作用及機制進行綜述。

1 抗腫瘤經典途徑

ASA可通過環氧酶 (cyclooxygenase,COX)、NF-κB/IκB、Bax/Bcl-2、TRAIL、誘導自噬、氧化應激等途徑發揮抗腫瘤作用。

1.1 COX

1.1.1 COX COX有三種同工酶。COX-1位于正常組織，有保護消化道黏膜、調節血小板聚集(通過TXA2)、調節血管張力(通過PGI2)、調節腎血流量的作用[7]。COX-2存在于中樞神經、腎臟、炎性反應區，具有生成致炎物質的作用[8]。COX-3在不同組織中表達不同，研究發現其在疼痛中扮演重要角色[8]。

1.1.2 ASA對COX作用[8]低濃度ASA導致COX活性中心的絲氨酸乙酰化失活，該過程不可逆，TXA2生成減少，血小板聚集及血栓形成受到抑制，從而產生抗凝作用。高濃度ASA能抑制血管壁中COX，減少PGI2生成。

1.1.3 ASA抑制COX-2抗腫瘤 COX-2可使人骨髓細胞、人乳腺癌和結腸癌中花生四烯酸轉化為PGE2[9,10]。PGE2通過活化磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)、c-Jun氨基末端激酶(C-jun amino-terminal kinase，JNK)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)啟動致癌信號通路,刺激肺癌細胞生長[11]。ASA抑制COX-2，減少PGE2的生成和抑制絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK) 的活性，可使肝癌細胞增殖受到抑制[12]。COX-2在40%～50%的良性息肉和80%～90%的腺癌中過表達，ASA可抑制COX-2，降低結腸癌發生[13]。體外實驗發現ASA通過抑制COX-2 能夠下調PI3K信號通路的活性，并能改善PIK3CA突變結直腸癌患者的預后[14]，降低特異性死亡率[14]。COX-2抑制劑可降低結直腸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤的發病率[15]。另外，COX-2通過整合素avβ3，基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases ，MMPs) 合成，VEGF、bFGF等血管生成因子的表達等途徑，促進腫瘤血管的生成，ASA抑制COX-2可能是預防胃癌的機制之一[16,17]。

1.1.4 ASA抑制COX-1抗腫瘤 腫瘤細胞脫離原發腫瘤進入循環并受剪切力和免疫攻擊，大多數被NK細胞破壞，也有一些會觸發血小板活化并形成保護性的“血小板涂層”[18]。血小板聚集可使腫瘤細胞逃避免疫系統監測，又被稱為腫瘤細胞誘導血小板聚集(Tumor cells induce platelet aggregation，TCIPA)[19]。COX-1存在于血小板使其合成TXA2，TXA2促進血小板聚集[20]。COX-1可促進血小板的激活，活化的血小板產生轉化生長因子-β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等細胞因子與炎性因子可促進腫瘤細胞生長、轉移及血管生長，協助腫瘤細胞逃脫免疫殺傷[21]。ASA通過抑制COX-1的活性,使血小板的活化和聚集受抑制,從而發揮抑制癌細胞轉移的作用[22]。上皮-間充質轉變 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤浸潤和轉移過程中發揮重要的作用，結腸癌在浸潤和轉移過程中，癌細胞逐漸失去上皮特性,同時獲得間充質細胞的表型特征，發生EMT[23]。ASA通過上調E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達，下調N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snail1表達抑制結腸癌HT-29細胞EMT，從而抑制其遷移及侵襲能力[23]。

1.2 NF-κB/IκB 通常NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IkB)結合以非活性的形式存在，NF-κB激活后誘導抗細胞凋亡基因表達(圖1)。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)等磷酸化并降解IκB，NF-κB的核定位信號被暴露，并迅速轉移到細胞核內，與特異性κB序列結合，誘導相關基因轉錄。其活化可影響許多前炎性介質如TNF-α、IL-8及COX-2等合成和釋放[24]。在人類癌細胞模型、大腸癌細胞中ASA可以抑制NF-κB核易位促進腫瘤細胞凋亡[25-27]。NF-κB還可改變IκB激酶 (IKK)、ERK、p38MAPK、細胞周期依賴性蛋白激酶 (cell cycle-dependent protein kinases，CDKs)的活性，抑制腫瘤細胞生長[28]。

圖1 NF-κB引起抗凋亡基因表達

NF-κB與IkB結合后失活，IKK可磷酸化IkB，IkB與NF-κB分離，NF-κB進入細胞核并引起抗凋亡基因表達。ASA與IκB結合阻止其被IKK磷酸化，也可與IKK-2結合抑制其活性，NF-κB不能進入細胞核，從而促進腫瘤細胞凋亡

1.3 Bcl-2 B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族抗凋亡成員有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-B、Mcl-1、A1，促凋亡成員有Bax、Bak、Bok、Bid、Bim、Bik、Bad、Bmf、Hrk、Noxa、Puma[29]。Bcl-2通過增強線粒體膜電位，抑制鈣離子的跨膜移動，從而使核酸內切酶無法活化,抑制細胞凋亡[30]。Bax基因通過直接激活死亡效應因子半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶 (cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspases) ，或改變細胞膜通透性引起細胞色素C釋放，伴有細胞膜通透一些離子以及小分子物質而促進細胞凋亡[30]?？傊?，Bcl-2和Bax兩者通過特定比例調控腫瘤凋亡。Bcl-2處于高表達時，抑制細胞凋亡，而當Bax高表達時，促進細胞凋亡[31]。ASA在控制多發性骨髓瘤、卵巢癌的發生發展中，通過上調Bax基因、抑制Bcl-2基因活性也是其主要機制之一[31]。ASA促使結腸癌SW480細胞Bax表達上調， Bcl-2表達下調，從而抑制SW480細胞的增殖、遷移和侵襲能力[32]。ASA可使人小細胞肺癌A549細胞中Caspase-3活化，引起凋亡[33]。

1.4 TRAIL 腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)與死亡受體4(Death receptor 4，DR4)和死亡受體5(Death receptor 5，DR5)結合時引起腫瘤細胞凋亡而對大多數正常細胞呈低毒性[34]。尤其DR5受體廣泛表達于黑色素瘤、食管癌、直腸癌等腫瘤組織而在正常組織細胞中幾乎不表達[33]。TRAIL介導的凋亡信號通路包括外源性通路(死亡受體凋亡通路)和內源性通路(線粒體凋亡通路)[34]，見圖2。實驗表明，ASA可增強TRAIL誘導的肝癌SMMC-7721細胞、Hep G-2細胞凋亡作用[33]。ASA通過增強DR5的表達、引起DR5聚集、激活凋亡信號的轉導途徑，促進食管癌細胞凋亡[30]。干擾素及一些化療藥物這類因素,通過提高DR5的表達增加細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性[30]。

1.5 自噬 自噬又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡,生物膜包裹待分解物形成自噬體，運送到溶酶體后形成自噬溶酶體，胞質中絕大多數物質被分解，以滿足細胞的代謝和某些細胞器更新的需求[35]。在腫瘤細胞中，自噬早期階段通過清除腫瘤細胞內異常折疊的蛋白、功能異常的細胞器 (線粒體),抑制細胞應激反應，防止基因組損傷從而抑制癌癥發生，自噬在后期階段可促進腫瘤細胞存活，協助免疫逃逸[35]。mTOR是真核細胞啟動自噬中一個關鍵的抑制性調節因子，受多條通路調節，激活mTOR的通路如Akt和MAPK信號通路，負調控mTOR的通路如AMPK和p53信號通路[36]。ASA通過激活AMPK促進腫瘤細胞的自噬和凋亡的[35]。結直腸癌細胞模型中，ASA對結腸直腸癌AMPK/mTOR信號通路的多個組成部分產生作用，涉及mRNA穩定性、細胞周期、自噬、蛋白質翻譯和核糖體生物發生的細胞通路，ASA通過抑制mTOR和激活AMPK來誘導自噬[37]，見圖3。

圖2 腫瘤細胞中TRAIL誘導凋亡[34]

1.6 穩定MMR DNA修復途徑其中之一是DNA錯配修復(mismatch repair，MMR)系統。該系統由蛋白質復合物組成，對突變損傷有反應，在不利條件下能夠直接修復錯配堿基或者觸發程序性死亡[28]。研究表明ASA可以減少腫瘤組織中遺傳異常的積累[38]。在結直腸癌中，ASA可增加MMR的穩態水平,防止基因異常的累積[28]。ASA在MMR豐富的細胞中能誘導更多的細胞凋亡，表明ASA通過減少細胞突變預防腫瘤的產生[28]。

1.7 氧化應激 通過內源性途徑如線粒體、過氧化物酶體、細胞色素P450，外源性途徑如紫外線、放射線炎性細胞因子、病原體等產生具有細胞毒性的氧源物質，如超氧自由基、過氧化氫、單線態氧和羥基自由基，這類物質可提高氧化應激水平，通過損傷ASA增加AMPK和ULK1的磷酸化。ASA降低S6K1、S6和4E-BP1的磷酸化來抑制mTOR信號通路。TSC1/2：結節性硬化蛋白1/2；raptor：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的調控相關蛋白；ACC：乙酰輔酶A羧化酶；AMPK：腺苷一磷酸活化蛋白激酶；CRC：結腸直腸癌；eIF4E：真核翻譯起始因子4E；4E-BP1：4E，結合蛋白1；HuR ：人類抗原R；LC3：輕鏈3；MEF：小鼠胚胎成纖維細胞；mTOR：雷帕霉素的機械靶點；NDRG1：N-myc下游調節1；NSAID：非甾體類抗炎藥；PBS：磷酸鹽；PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶；siRNA：小干擾RNA；S6：S6核糖體蛋白；S6K1：S6核糖體蛋白激酶1核酸、蛋白質、脂類導致染色體不穩定、突變、細胞器功能喪失、膜損傷，促使癌癥發生[39]。細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)通過調節相關信號通路導致EMT，促進腫瘤細胞轉移[40]。ROS介導NF-κB 、轉錄因子3 (activating transcription factor 3，ATF3) 的激活和DNA損傷在誘導腫瘤細胞凋亡中起到重要作用[16]。由巨噬細胞、腫瘤相關成纖維細胞、缺氧、衰老成纖維細胞、癌細胞組成的腫瘤微環境促進氧化應激的形成，導致腫瘤進展[41]。在肝炎導致肝癌的發生過程中，肝炎病毒基因表達，通過氧化應激產生DNA損傷、激活細胞激酶和轉錄因子，導致肝細胞癌的發生[39]。癌細胞有腫瘤抑制基因突變時會逃避ROS誘導的細胞衰老或死亡，出現不可控的增殖[40]。ASA可以誘導ROS的產生，促進氧化應激、細胞凋亡和進一步阻礙線粒體呼吸功能，從而產生細胞毒性反應[42]。結直腸癌發生過程中與ROS過量產生有密切關系，抗氧化劑，如γ-生育酚，生育三烯醇和ASA，可以減少氧化應激和ROS的過量產生[43]。另外，一氧化氮釋放型ASA(NO-ASA)由酯鍵與NO供體基團連接，釋放的NO引起氧化應激誘導癌細胞凋亡[44]。NO-ASA有望成為結腸癌和其他癌癥的防治藥物[45]。

圖3 ASA激活AMPK抑制mTOR誘導結直腸癌細胞自噬[37]

1.8 其他 E-cadherin廣泛存在于上皮細胞中維持細胞形態和細胞黏附，但在腫瘤細胞中表達降低，腫瘤侵襲力增強[46]。ASA可上調E-cadherin表達水平，抑制結腸癌細胞EMT的發生[46]。實驗表明肝癌組織經ASA治療后E-cadherin表達明顯增加，肺轉移節結數明顯減少[46]。激活蛋白-1(Activated protein -1，AP-1)促進腫瘤形成，而谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione-S-transferase，GST)屬于解毒酶，ASA通過抑制AP-1，增強GST-θ，有預防癌的形成的作用[47]。

2 對腫瘤細胞糖代謝的影響

ASA降低糖代謝，18F氟脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG)在體內的生物學行為與葡萄糖類似[48]。研究顯示ASA可降低結腸癌患者腫瘤細胞對18F-FDG的攝取率，具體機制尚不明確。缺氧可誘導人結腸癌細胞株HCT116停滯于G0/G1期，減少其早期凋亡，増加遷移和侵襲能力。隨著缺氧時間的延長，HCT116中乙醛脫氫酶-1(Acetaldehyde dehydrogenase-1，ALDH-1)陽性細胞相對活力數有所增加。缺氧還可促進結腸癌細胞萄糖代謝相關載體葡萄糖轉運蛋白-1(Glucose transporter protein-1，Glut-1)在蛋白和mRNA水平的表達。ASA可部分逆轉上述缺氧誘導的HCT116生物學行為的改變，如ASA可抑制缺氧誘導的G0/G1期細胞周期停滯而促進早期凋亡，降低遷移和侵襲能力；減少缺氧誘導的ALDH-1陽性細胞數及Glut-1的表達。ASA作用于COX-2靶點可能與以上生物學行為的改變有關。

3 對機體免疫系統的影響

3.1 增效免疫治療 皮膚癌,乳腺癌和大腸癌細胞可產生大量PGE2,能減弱免疫系統對病變細胞的正常應答，腫瘤因此快速增殖[49]。ASA抑制PGE2 的產生免疫系統被重新喚醒[49]。將免疫療法與ASA或其他COX抑制劑聯合使用比單獨使用免疫療法更能抑制小鼠體內大腸癌或黑色素瘤的生長[49]。

3.2 鈣網蛋白 其在腫瘤細胞的表面表達比正常的細胞多[50]。鈣網蛋白與固有免疫細胞，如巨噬細胞，樹突狀細胞等的表面受體CD91/l RP1結合,增強免疫系統對腫瘤細胞的免疫應答[50]。通過誘導劑使人肝癌細胞Hep G2高表達鈣網蛋白，從而產生更高的免疫原性,使免疫系統更好地殺傷和清除腫瘤細胞[50]。

3.3 人白細胞-DR抗原(HLA-DR) 結腸癌形成中HLA-DR低表達有利于逃避免疫監視。Arvind等[51]用ASA、消炎痛及蘇靈達誘導HT-29細胞表達HLA-DR α，從而調節腫瘤患者的免疫功能。

3.4 細胞因子平衡 免疫細胞及相關細胞因子在腫瘤發生中起重要作用。IL-10抑制細胞免疫，而IL-12可增強細胞免疫起到抗腫瘤作用。PGE2可以調節淋巴細胞以及巨噬細胞產生的IL-10和IL-12之間的平衡，增加IL-10以及減少IL-12產生，促進腫瘤發生。ASA可恢復此平衡，增強T細胞介導的免疫應答，起到預防腫瘤形成的作用[5]。

3.5 Fas/FasL 自殺相關因子(factor associated suicide，Fas)即CD95,是一種跨膜糖蛋白,與程序性細胞死亡 (programmed cell death，PCD) 密切相關。Fas在體內的組織細胞，如激活的T細胞、B細胞、單核細胞、中性粒細胞等中廣泛表達。細胞表面的Fas與FasL配體結合,細胞內caspase8被活化，從而啟動細胞凋亡機制。免疫細胞表達的Fas與腫瘤細胞表達的FasL結合后,通過Fas/FasL信號傳導途徑,免疫細胞凋亡,腫瘤細胞從而逃避免疫殺傷[52]。ASA降低結腸癌SW-480細胞Fasl蛋白表達后淋巴細胞凋亡率明顯降低[53]。ASA通過誘導Fas表達、下調FasL表達抑制結腸癌細胞Caco-2細胞增殖，促進凋亡[54]。ASA能直接與細胞核中的p300相互作用，促進H3K9乙酰化，激活FasL表達，誘導結腸直腸腫瘤干細胞的凋亡[55]。

ASA在解熱、鎮痛、抗炎、心血管疾病等方面的應用已被人熟知，其在抗腫瘤方面的作用逐漸被發現，抗腫瘤機制研究也在逐步深入。抗腫瘤機制與其對COX的藥理作用密切相關，同時非COX途徑如NF-κB/IκB、Bax/Bcl-2、TRAIL、誘導自噬、氧化應激等也是ASA抗腫瘤的重要途徑。近年來還發現，ASA通過降低糖代謝誘導結腸癌細胞凋亡，增強免疫系統功能促進殺傷腫瘤細胞。研究表明，糖尿病大鼠服用ASA后TNF-α的釋放減少，胰島素敏感性增強，證明ASA具有胰島素增敏作用，可改善胰島素抵抗，糾正脂質代謝紊亂，抑制炎性因子釋放。但ASA影響內分泌系統后是否對腫瘤細胞產生作用仍需進一步研究[56]。ASA抗腫瘤機制、對機體及腫瘤細胞代謝的影響也需要進一步探究?？傊?，ASA有望早日在臨床方面應用于腫瘤的預防和規范化輔助治療。