細胞周期蛋白D1、p27及增殖細胞核抗原在前列腺癌中的表達及意義

于賀軍，李冰，薛秀娟，徐璐，程棟

1新鄉市疾病預防控制中心性病艾滋病防治科，河南 新鄉 453000

2新鄉市中心醫院檢驗科，河南 新鄉 453000

2018年全球腫瘤統計數據結果顯示，全球約有1819萬惡性腫瘤新增病例，約有960萬惡性腫瘤死亡病例。在全球范圍內，前列腺癌的發病率位居第3位，占全球總發病人數的7.1%[1]。在中國，前列腺癌的發病率和病死率均位居男性惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌，嚴重危害男性的健康，尤其是老年男性的健康[2]。因此，進一步探討前列腺癌的病因及發病機制是必要的。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是一種與細胞增殖密切相關的周期蛋白，在多種類型的腫瘤中異常表達，與腫瘤的發生、發展密切相關[3]。p27作為細胞周期的負調控因子，通過抑制細胞增殖參與腫瘤的發生、發展[4]。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）與細胞合成DNA的過程密切相關，作為細胞增殖的標志物，其表達量的增加預示著腫瘤細胞的增殖能力進一步增強[5]。本研究采用免疫組化法檢測cyclin D1、p27、PCNA在前列腺癌組織中的表達情況，以進一步探討前列腺癌的發病機制，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年12月至2019年12月新鄉市疾病預防控制中心和新鄉市中心醫院收治的接受經尿道前列腺切除術的86例前列腺癌患者。納入標準：均經病理檢查證實，且術前均未接受過內分泌治療和放療。排除標準：合并心、肝、腎等嚴重疾病；合并其他腫瘤；有其他藥物治療史。前列腺癌患者的年齡為49～78歲，中位年齡為65歲，其中，≤65歲42例，＞65歲44例；根據美國癌癥聯合會前列腺癌TNM分期系統（2018年）[6]進行分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例；參照2011版《中國泌尿外科疾病診斷指南》[7]，Gleason評分≤7分為中高分化（n=64），＞7分為低分化（n=22）；有骨轉移43例，無骨轉移43例。另收集同期38例前列腺增生患者，納入標準：年齡為50～80歲；國際前列腺癥狀評分（international prostatic symptom score，IPSS）高于13分，殘余尿量在150 ml以內。排除標準：合并膀胱結石、膀胱頸硬化、尿道狹窄、前列腺癌、膀胱腫瘤等；合并心、肝、肺、腎功能障礙等。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準，患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人cyclin D1、p27和PCNA多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。RMI128切片機購自德國萊卡公司；BH-2顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.3 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學染色法檢測前列腺癌組織和前列腺增生組織中cyclin D1、p27及PCNA的表達情況。所有標本經10%福爾馬林固定、脫水、透明、石蠟包埋，切成厚度為5 μm切片，放入60℃烤箱烘烤后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度乙醇脫水，微波爐加熱進行抗原修復，采用3%過氧化氫進行內源性滅活，切片分別滴加cyclin D1、p27及PCNA一抗工作液，4℃孵育過夜，次日滴加生物素二抗工作液，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，光鏡下觀察cyclin D1、p27及PCNA的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判讀

根據染色強度以及高倍鏡下陽性細胞所占比例進行分析。cyclin D1、p27及PCNA陽性細胞主要定位于細胞質、細胞核，陽性顆粒呈棕黃色。采用半定量積分法對染色結果進行判定：每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，統計陽性細胞數，分析其染色程度。陽性細胞所占百分比：陽性細胞所占百分比≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。陽性細胞染色強度：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。上述兩項相乘的得分為最終得分，其中，0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9分及以上為強陽性（+++）。中等陽性和強陽性表示細胞陽性表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman等級相關分析法進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中cyclin D1、p27、PCNA表達情況的比較

前列腺癌組織中cyclin D1、PCNA的陽性表達率均明顯高于前列腺增生組織，p27的陽性表達率明顯低于前列腺增生組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中cyclin D1、p27、PCNA陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 cyclin D1、p27、PCNA 與前列腺癌患者臨床特征的關系

低分化、有骨轉移的前列腺癌患者前列腺癌組織中p27的陽性表達率分別低于高分化、無骨轉移的前列腺癌患者，PCNA的陽性表達率分別高于高分化、無骨轉移的前列腺癌患者，差異均有統計學意義（χ2=5.723、24.870、4.724、18.169，P＜0.05）。不同年齡、TNM分期前列腺癌患者前列腺癌組織中p27、PCNA的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同年齡、分化程度、TNM分期、骨轉移情況前列腺癌患者前列腺癌組織中cyclin D1的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 不同臨床特征前列腺癌患者前列腺癌組織中cyclin D1、p27、PCNA的陽性表達情況

2.3 前列腺癌組織中cyclin D1、p27、PCNA表達的相關性

相關性分析結果顯示，前列腺癌組織中cyclin D1與p27的表達呈負相關（r=-0.687，P＜0.01），cyclin D1與PCNA的表達呈正相關（r=0.612，P＜0.01），p27與PCNA的表達呈負相關（r=-0.598，P＜0.01）。

3 討論

D型細胞周期蛋白家族包括cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3三種蛋白，其中，cyclin D1主要位于染色體11q13，含有5個外顯子和4個內含子，能夠編碼含有295個氨基酸的蛋白質，分子量約為34 kD。cyclin D1通過與細胞周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinases 4/6，CDK4/6）結合使視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化，釋放轉錄因子E2F，進而啟動脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的合成，加速細胞周期從G1期向S期轉變，因此，其具有腫瘤基因的性質，能夠造成細胞增殖失控及惡性生長，最終形成腫瘤[8]。研究顯示，cyclin D1在多種惡性腫瘤中的表達量明顯增加。本研究發現，前列腺癌組織中cyclin D1的陽性表達率明顯高于前列腺增生組織，與相關研究結果[9-10]類似，說明cyclin D1作為腫瘤基因參與前列腺癌的發生、發展。亦有研究發現，通過抑制cyclin D1的表達能明顯阻滯DU145前列腺癌細胞的細胞周期[11]，說明cyclin D1可能能夠作為前列腺癌基因治療中的一種靶基因。

p27是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子家族成員之一，通過參與細胞周期的調控從而影響細胞的生物學行為。p27作為細胞周期負性調控因子，通過抑制CDK的活性阻止G1期向S期轉化，抑制細胞增殖，從而被認為是一種腫瘤基因參與腫瘤的發生、發展[12]。劉偉等[13]的研究發現，前列腺癌組織中p27的陽性表達率低于前列腺增生組織，并與患者的Gleason評分、骨轉移情況及TNM分期有關。廖順鴻[14]的研究表明，前列腺癌組織中p27的陽性表達率低于癌旁正常組織，并與腫瘤的分化程度、轉移情況密切相關。本研究的結果與上述研究結果類似，p27在前列腺癌組織中的陽性表達率明顯低于前列腺增生組織，并與腫瘤的分化程度、骨轉移情況有關，與年齡、TNM分期無關，說明p27與前列腺癌的發生、發展及分化密切相關，通過上調p27的表達能在一定程度上抑制前列腺癌的發生、發展及轉移。

PCNA是1978年從系統性紅斑狼瘡中發現并命名的一種存在于細胞核中的蛋白質，定位于人染色體20，并與細胞合成DNA密切相關。PCNA在細胞周期G0期開始表達，S期達到峰值，M期開始回落。本研究發現，前列腺癌組織中PCNA的陽性表達率明顯高于前列腺增生組織，并與腫瘤的分化程度、骨轉移情況密切相關，與TNM分期無關，與相關研究結果[15-16]一致，說明PCNA的陽性表達率越高，前列腺癌細胞增殖越旺盛，細胞分化程度越低，復制時間越短，轉移速度越快。

本研究的相關性分析結果顯示，前列腺癌組織中cyclin D1與p27的表達呈負相關，cyclin D1與PCNA的表達呈正相關，p27與PCNA的表達呈負相關。有研究發現，cyclin D1與PCNA在惡性多形性腺瘤中的表達呈正相關[15]。cyclin D1與p27在胃癌組織中的表達呈負相關，二者在胃癌的發生、發展過程中起重要作用[17-19]。cyclin D1、p27、PCNA三者聯合檢測可能能夠為前列腺癌的診斷與治療提供依據。

綜上所述，cyclin D1、PCNA在前列腺癌組織中的陽性表達率高，p27在前列腺癌組織中的陽性表達率低，且PCNA、p27的表達情況與前列腺癌的分化程度和骨轉移情況密切相關。三者在前列腺癌中的表達具有相關性，參與前列腺癌的發生、發展及轉移，其聯合檢測可能能夠為前列腺癌的診斷提供依據。