白細胞介素-6和磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3在子宮內膜癌中的表達及相關性研究

車祺，劉素英，董曦

復旦大學附屬中山醫院生殖醫學中心，上海 200032

子宮內膜癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，發病率占女性生殖系統惡性腫瘤的20%～30%，近年來其發病率呈持續上升趨勢，且發病年齡逐漸降低，呈年輕化趨勢[1-2]。子宮內膜癌的發病率和病死率均較高，可嚴重威脅女性的生命健康和生存質量，早期診斷及有效治療至關重要。白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）已被證實可促進多種惡性腫瘤的發生發展[3-4]。IL-6是一種多效細胞因子，在多種病理生理過程中均可發揮重要作用，是STAT3的經典激活因子[5]。正常生理狀況下，STAT3激活狀態的持續時間非常短，但也可對正常細胞的生理功能發揮重要作用，如負責將細胞外的信號傳遞到細胞核，誘導靶基因的轉錄表達。在多種致癌因子的刺激下，多種腫瘤細胞內的STAT3可發生磷酸化（p-STAT3），呈持續活化狀態，引起與細胞增殖、分化、凋亡、代謝相關的關鍵基因異常高表達，最終導致細胞異常增殖和惡性轉化，從而形成惡性腫瘤，表現出致癌作用[6]。目前，關于IL-6和p-STAT3在子宮內膜癌中的具體作用機制和相互關系仍未完全闡明，包括IL-6和磷酸化STAT3-酪氨酸705（STAT3 phosphorylation-tyrosine 705，pSTAT3-Tyr705）和磷酸化STAT3-絲氨酸 727（STAT3 phosphorylation-serine 727，pSTAT3-Ser727）的相關性，因此，本研究探討IL-6和p-STAT3在子宮內膜癌中的表達及相關性研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年2月在復旦大學附屬中山醫院接受手術治療的子宮內膜癌患者，納入標準：病理學檢查符合世界衛生組織（WHO）子宮內膜癌的診斷標準；術前均無發熱感染病史。排除標準：①合并內外科疾病；②術前有放化療史；③性激素服用史；④妊娠期、哺乳期女性。依據納入和排除標準，本研究共納入61例子宮內膜癌患者，年齡32～71歲，平均（54.9±7.6）歲，中位年齡55歲。同期選取正常子宮內膜良性病變患者作為對照組，納入標準：因子宮良性病變（如子宮肌瘤等）接受全子宮切除術的患者；術前均無發熱感染病史。排除標準：①存在子宮內膜病變；②性激素服用史；③刮宮史。依據納入和排除標準，本研究共納入20例子宮良性病變患者，年齡36～65歲，平均（51.8±7.6）歲，中位年齡51歲。取61例子宮內膜癌患者的子宮內膜癌組織，以及20例子宮良性病變患者的正常子宮內膜組織。

1.2 免疫組化法檢測IL-6、pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727蛋白的表達情況

免疫組化試劑盒購自上海明睿生物技術有限公司，取61例子宮內膜癌患者的子宮內膜癌組織、20例子宮良性病變患者的正常子宮內膜組織，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，3 μm連續切片，60℃恒溫箱中烘烤過夜備用。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；抗原修復封閉內源性過氧化物酶。加入一抗，置于濕盒中，4℃孵育過夜；加入二抗，37℃孵育30 min；鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶，37℃孵育10 min；每張切片滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑50 μl，光學顯微鏡下控制顯色2～5 min，適時用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）溶液沖洗以終止顯色；蘇木素對比染色細胞核；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。IL-6抗體的工作液稀釋比例為1∶100，pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727抗體的工作液稀釋比例均為1∶200。

1.3 結果判定

IL-6主要定位于細胞質，pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727蛋白主要定位于細胞核，以細胞核或細胞質內呈棕黃色顆粒為陽性，參考Fromowitz的評分標準[7]，采用半定量積分法，對每個高倍視野（×400）中的陽性細胞所占比例及細胞著色強度進行評分。著色強度評分：無著色計為0分，淡黃色著色計為1分，棕黃色著色計為2分，棕褐色著色計為3分；陽性細胞所占比例評分：陽性細胞所占比例＜1%計為0分，1%～25%計1分，26%～50%計2分，＞50%計3分。將著色強度和陽性細胞所占比例評分相加，即為免疫組化評分。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對所有數據進行統計學分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-6、pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727蛋白表達情況的比較

正常子宮內膜組織中IL-6、pSTAT3-Tyr705、pSTAT3-Ser727蛋白的免疫組化評分均明顯低于子宮內膜癌組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（圖1、表1）

圖1 不同組織中IL-6、pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727蛋白的表達情況（免疫組化染色，×40）

表1 不同組織中IL-6、pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727蛋白免疫組化評分的比較（±s）

表1 不同組織中IL-6、pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727蛋白免疫組化評分的比較（±s）

組織I L-6 p S T A T 3-T y r 7 0 5 p S T A T 3-S e r 7 2 7

2.2 子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中IL-6與pSTAT3-Tyr705、pSTAT3-Ser727表達的相關性

Spearman相關分析結果顯示，IL-6的表達與pSTAT3-Tyr705、pSTAT3-Ser727的表達均相關（r=0.512、0.593，P＜0.01）。

3 討論

越來越多的證據表明，STAT3可能是一種原癌基因[8-9]。因此，深入研究STAT3信號通路在腫瘤發生、發展和轉移中的作用，不僅對闡明腫瘤的發病機制有重要意義，還可為腫瘤的靶向治療奠定基礎。本研究探討IL-6、pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727在正常子宮內膜組織和子宮內膜癌組織中的表達情況；同時，采用免疫組織化學評分法評估IL-6與兩種磷酸化STAT3的表達相關性。

STAT3是一種重要的信號核轉錄蛋白，人類編碼的STAT3基因位于第17號染色體（q21），全長15 170 bp，含 24 個外顯子[10]。JAK/STAT3 通路是STAT3上游眾多的信號通路中最重要的信號轉導與轉錄激活途徑：IL-6與其受體結合后，受體細胞內構型發生改變，與gP130形成二聚體，通過細胞質內JAK酪氨酸蛋白激酶，使STAT3的酪氨酸發生磷酸化。磷酸化的過程就是活化過程，STAT3的活化是STAT3發揮作用的關鍵：細胞質內的STAT3單體先在C末端的磷酸化位點（酪氨酸705、絲氨酸727位點）發生磷酸化，然后2個磷酸化的STAT3在SH2區構成一個鉸鏈結構，形成同源二聚體，可以轉移入細胞核內，進而與下游基因相應的轉錄調節位點相結合，引起下游基因的異常表達[11-12]。這些靶基因包括編碼炎性因子和腫瘤刺激因子的基因，其表達可引起機體發生慢性炎癥和腫瘤[13]。IL-6是一種免疫炎性細胞因子，感染后可以激活免疫系統，從而促進IL-6的分泌，發揮免疫保護作用[5]。因此，本研究排除了感染患者，以免干擾免疫組化的檢測結果。

Chen等[9]對子宮內膜腺癌組織和正常子宮內膜組織進行檢測，結果顯示，STAT3的陽性表達率為20.8%（24/115），其中組織學分級Ⅰ～Ⅲ級的子宮內膜腺癌組織中STAT3的陽性表達率分別為11.8%、25.8%和27.3%，而正常組織中幾乎未檢測到，表明STAT3的激活發生在子宮內膜癌的早期階段，且隨著組織學分級的升高，STAT3的表達水平逐漸升高，認為STAT3可以作為抗子宮內膜癌治療的有效的靶點。朱麗霞等[14]采用免疫組化法檢測子宮內膜組織中STAT3的表達情況，結果顯示，子宮內膜癌患者中STAT3陽性表達率為64%，而對照組子宮內膜組織中STAT3的陽性表達率僅為20%。

生理條件下，IL-6可調節免疫和炎性反應，并與基底細胞癌、乳腺癌和卵巢癌等多種腫瘤相關，磷酸化的STAT3是IL-6信號轉導通路的重要分子介質[15]。本研究結果顯示，正常子宮內膜組織中IL-6、pSTAT3-Tyr705、pSTAT3-Ser727蛋白的免疫組化評分均明顯低于子宮內膜癌組織。Chen等[9]研究顯示，pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-Ser727在子宮內膜癌組織中均被激活，與本研究結果一致。在未受刺激的細胞中，STAT3以非活性形式存在于細胞質中，一旦被激活，即由細胞質轉入細胞核[1-3]。本研究結果還顯示，子宮內膜癌細胞核內的p-STAT3表達陽性，這表明STAT3信號通路的激活可能是子宮內膜癌進展的重要因素。已有證據表明，子宮內膜癌患者血清中IL-6水平較高，且與患者的預后不良密切相關[16-17]。本研究進一步分析顯示，IL-6與pSTAT3-Tyr705、pSTAT3-Ser727的表達呈正相關，表明IL-6可能通過STAT3信號通路促進了子宮內膜癌的發生發展。這些發現表明IL-6和STAT3是子宮內膜癌的重要治療靶點，但其中具體的調節機制還有待進一步研究。

綜上所述，與正常子宮內膜相比，子宮內膜癌中IL-6和pSTAT3-Tyr705、pSTAT3-Ser727的表達顯著升高，且IL-6與后兩者的表達呈正相關，說明IL-6可能通過兩種磷酸化的STAT3通路，來促進了子宮內膜癌的發生發展，其具體機制還需進一步探討。