大蒜素對大鼠燒傷創面愈合的影響及其機制?

浦春寧 陳 驊△ 凌書建

（1.中國人民武裝警察部隊海警總隊醫院，浙江 嘉興 314000；2.河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056000）

燒傷是一種因熱力如火、熱氣、熱液體等導致的人體組織器官損傷，包括電燒傷、化學品燒傷，發病率居外傷疾病譜第4位，每年僅因火燒傷致死患者超過30萬，此外還有大量患者因燒傷致殘、致畸，給家庭和社會造成巨大危害[1]。按照“三度四分法”分級，燒傷深度可分為Ⅰ度、淺Ⅱ度、深Ⅱ度和Ⅲ度燒傷，其中深Ⅱ度燒傷臨床最為常見。皮膚是燒傷最易損傷的組織，創面組織恢復是燒傷治療的關鍵，若創面愈合不佳易形成瘢痕甚至繼發感染，危及生命。病理生理學研究發現，氧自由基過度累積誘發創面組織水腫、炎癥反應、阻滯修復細胞遷移和增殖等氧化應激反應是影響燒傷創面愈合的重要因素[2]。大蒜素是天然存在的一種二烯丙基三硫化物，具有良好的抗氧化活性[3-4]。本實驗以深Ⅱ度燒傷大鼠模型為研究對象，研究大蒜素對大鼠燒傷創面愈合的影響并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 180只無病原微生物級雄性Wistar大鼠，8周齡，體質量220～250 g，由河北省實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（冀）2018-004]；實驗過程嚴格按照國家衛生實驗動物護理和使用指南進行。

1.2 試藥與儀器 大蒜素注射液購自黑龍江江世藥業有限公司（批號：20190326）；磺胺嘧啶銀軟膏購自沈陽紅旗制藥有限公司（批號：181225）；乳酸鈉林格注射液購自安徽雙鶴藥業有限公司（批號：20190426）；羥脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒購自北京博奧森生物技術有限 公 司（ 批 號 ：20190329、20190508、20190317、20190114）；兔抗鼠表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞因子（bFGF）、β-actin單克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司（批號：201904015、201905027、20190514）；ECL超敏化學發光液購自美國Thermo Fisher Scientific公司（批號：EB190217）。YLS-5Q型燙傷儀（天津科技發展有限公司）；Allegra 21R型低溫離心機（美國Beckman公司）；UV2100型雙光束紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；Muhiskan FC型酶標儀（美國Ameritech公司）；CUT 4050型旋轉切片機（德國Leica公司）；Tetra Systerm型垂直電泳槽、Power Pac Basic轉膜槽（美國Bio-Rad公司）；CKX41型倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 分組與造模 適應性飼養1周后開展實驗，對所有大鼠編碼后按照隨機數字表法分為：假燒傷組，模型組，磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組，各30只。參照鄭國鈺等[5]報道的方法制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型：各組大鼠禁食禁水12 h后，腹腔注射水合氯醛溶液（濃度10%，劑量0.3 mL/100 g）實施麻醉，剃除背部毛發后用8%的Na2S溶液脫毛，溫水沖洗并用75%乙醇消毒，假燒傷組立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5 mL抗休克；其余各組大鼠均采用燙傷儀制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型，參數設置為：壓力0.03 MPa、溫度106℃持續時間5 s，通過病理切片證實造模成功（病理切片呈現：部分真皮層內細胞壞死，部分毛囊等附件殘存，毛細血管擴張、管腔可見紅細胞及血液瘀滯），見圖1。造模完成后各組大鼠立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5 mL抗休克。

圖1 創面皮膚病理切片

1.4 干預方法 1）大蒜素劑量確定：成人使用劑量為60～120 mg/d，取平均值90 mg/d，設定人體質量為60 kg，則人每天給藥劑量為1.5 mg/kg。根據實驗動物給藥劑量換算公式，大鼠給藥劑量=6.3×人給藥劑量，得出給藥劑量為9.45 mg/kg≈10 mg/kg，因此本實驗取10 mg/kg為中劑量組，并設低劑量組5 mg/kg和高劑量組20 mg/kg。2）取大蒜素注射液加入適量0.9%氯化鈉溶液制備質量濃度為2.5、5、10 mg/mL的大蒜素溶液，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組于燒傷創面涂抹磺胺嘧啶銀軟膏（每2日換藥1次），同時分別每日1次腹腔注射2.5、5、10 mg/mL的大蒜素溶液2 mL/kg，假燒傷組和模型組每日1次腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2 mL/kg，磺胺嘧啶銀軟膏單藥組于燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏（每2日換藥1次），同時每日1次腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2 mL/kg。各組療程均為14 d。

1.5 標本采集與檢測 1）創面狀況觀察及創面組織病理學檢查。治療14 d后觀察各組大鼠燒傷創面狀況，包括皮膚顏色、結痂狀況、分泌物、愈合狀況等。各組分別隨機取10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創面皮膚組織，置4%多聚甲醛溶液72 h實施固定，經梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色、梯度酒精脫蠟、二甲苯透明后中性樹脂封片，然后通過光學顯微鏡觀察。2）創面愈合率的計算。各組隨機取10只大鼠，分別于給藥第0、14日后拍照燒傷創面，計算創面面積，創面愈合率（%）=（初始創面面積-未愈創面面積）/初始創面面積×100%。3）創面組織含水量的測定。將大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，切取創面皮膚組織，沖洗干凈后稱重（W1），置80℃烤箱烘烤24 h至恒重后稱量（W2），含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。4）創面組織HYP、MDA含量和SOD、CAT活性的測定。各組分別取剩余的10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，切取創面皮膚組織，于冰上剪碎后，加入9倍量冷裂解液行研磨勻漿，恒溫4℃離心（3 000 r/min，10 min）取上清，然后按照試劑盒操作方法，通過紫外可見分光光度計測定各組大鼠創面組織HYP、MDA含量和SOD、CAT活性。5）EGF、bFGF蛋白表達量的測定。取創面組織勻漿液，恒溫4℃離心（12 000 r/min，15 min）取上清，BCA法測定總蛋白含量后，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕法轉PVDF膜、5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，滴加兔抗鼠EGF、bFGF單抗（稀釋倍數1∶3 000）和兔抗鼠β-actin單抗（稀釋倍數1∶1 000）后4℃孵育12 h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗（稀釋倍數1∶500，37℃振蕩孵育1 h，PBS洗膜后滴加ECL顯色發光，運用凝膠成像系統獲得條帶；以β-actin為內參，以條帶灰度值半定量EGF、bFGF蛋白表達量。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，行方差齊性檢驗，方差齊兩兩比較行t檢驗，方差不齊采用Tamhane′st2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠創面狀況觀察結果 給藥治療14 d后，假燒傷組大鼠創面毛發生長茂盛，毛發長度基本恢復；模型組大鼠創面新生肉芽較少、結痂厚度不均勻，部分基底仍有黃色液體滲出；磺胺嘧啶銀軟膏組創面縮小、大部分痂下愈合，無滲出；磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組創面呈不同程度縮小、大部分痂下愈合，無滲出，新愈合皮膚紅潤，毛發開始生長，其中磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組效果最為顯著。

2.2 各組大鼠創面組織病理學檢查結果 見圖2。觀察HE染色病理切片發現：假燒傷組大鼠創面組織形態結構未見明顯異常；模型組創面出現較薄的新生上皮組織，可見壞死組織以及炎性細胞浸潤；磺胺嘧啶銀軟膏組和磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組上皮組織成熟較好、排列整齊，汗腺、皮脂腺等結構較為完整但仍較表淺，其中磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組可見表皮生成。

圖2 各組大鼠創面組織病理學檢查結果（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠創面愈合率測定結果比較 見表1。較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏組和磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組大鼠創面愈合率均顯著升高（P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組大鼠創面愈合率顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠創面愈合率和創面組織含水量比較（%，±s）

表1 各組大鼠創面愈合率和創面組織含水量比較（%，±s）

與假燒傷組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。下同

n組 別 愈合率 含水量假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組10 10 10 10 10 10-30.17±4.62 58.54±6.96△△61.27±7.03△△65.38±7.41△△#71.65±8.69△△##68.09±1.25 70.26±1.31**69.75±1.28 69.02±1.30△68.57±1.24△△68.23±1.19△△#

2.4 各組大鼠創面組織含水量測定結果比較 見表1。較假燒傷組，模型組大鼠創面組織含水量顯著升高（P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組創面組織含水量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組創面組織含水量顯著降低（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠創面組織HYP含量比較 見表2。較假燒傷組，模型組、磺胺嘧啶銀軟膏組及磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組大鼠創面組織HYP含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組HYP含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組HYP含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠創面組織HYP含量比較（μg/mg，±s）

表2 各組大鼠創面組織HYP含量比較（μg/mg，±s）

n組別假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組10 10 10 10 10 10 HYP 17.34±2.21 19.95±2.57*20.13±2.69*22.07±3.14**23.46±3.25**△#26.18±3.40**△△##

2.6 各組大鼠創面組織MDA含量和SOD、CAT活性比較 見表3。較假燒傷組，模型組大鼠創面組織MDA含量顯著升高，且SOD、CAT活性顯著降低（P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組MDA含量顯著降低，且SOD、CAT活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組MDA含量降低，且SOD、CAT活性升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠創面組織MDA含量和SOD、CAT活性比較（±s）

表3 各組大鼠創面組織MDA含量和SOD、CAT活性比較（±s）

組別假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組n 10 10 10 10 10 10 MDA（nmol/mg）0.97±0.18 4.63±0.72**4.40±0.75 3.79±0.68△2.66±0.49△△##1.85±0.36△△##SOD（U/mg）28.15±2.07 11.49±1.28**11.63±1.19 12.54±1.32 15.38±1.51△△##19.46±1.70△△##CAT（U/mg）23.74±1.93 14.65±1.22**14.28±1.37 15.91±1.53 16.24±1.86△#18.55±2.17△△##

2.7 各組大鼠創面組織EGF、bFGF蛋白表達量比較見圖3，表4。較假燒傷組，模型組、磺胺嘧啶銀軟膏組及磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組大鼠創面組織EGF、bFGF蛋白表達量均顯著上調（P＜0.05或P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組EGF、bFGF蛋白表達量顯著上調（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組EGF、bFGF蛋白表達量顯著上調（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠創面組織EGF、bFGF蛋白表達

表4 各組大鼠創面組織EGF、bFGF蛋白表達量比較（±s）

表4 各組大鼠創面組織EGF、bFGF蛋白表達量比較（±s）

組別假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組n 10 10 10 10 10 10 EGF β-actin 0.23±0.05 0.29±0.06*0.32±0.08**0.38±0.12**△0.52±0.10**△△##0.64±0.14**△△##bFGF β-actin 0.13±0.02 0.15±0.03*0.18±0.04**0.23±0.07**△△0.40±0.08**△△##0.51±0.12**△△##

3 討 論

燒傷創面處理是燒傷救治過程中的重點，良好的創面治療是改善燒傷患者生存質量、提高患者預后的關鍵。燒傷患者中以深Ⅱ度燒傷較為多見，其病理特點為燒傷創面雖然深度達真皮層，但仍有部分真皮組織及毛囊、汗腺等皮膚附件存活，創面治療及時有效則能夠依賴上皮增殖實現自行愈合，減輕燒傷瘢痕而改善外觀，降低傷殘[6]；若創面處理不當，則可能導致創面加深而轉變成Ⅲ度燒傷，從而增加治療難度并嚴重影響患者預后[7]。所以，深Ⅱ度燒傷治療結局具有較大的可變性，也是燒傷相關研究的熱點。

燒傷具有復雜的病理變化過程，其中氧化應激反應在其疾病進展過程中發揮著重要作用[8]。既往研究發現，通過藥物抑制氧化應激反應能夠降低燒傷大鼠心肌、肺、腎臟組織并發癥損傷[9-12]；胡澤華等[13]研究發現馬桑水提取物能夠通過抑制氧化應激損傷而促進深Ⅱ度燒傷大鼠創面組織愈合。大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種二烯丙基三硫化物，具有良好的抗氧化活性[3]。磺胺嘧啶銀軟膏具有清理創面、促進愈合的作用，是臨床燒傷治療的常用外用藥[14]。本研究通過制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型并在外用磺胺嘧啶銀軟膏的前提下，研究大蒜素對深Ⅱ度燒傷大鼠創面愈合的影響，結果顯示：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著改善創面愈合狀況、改善創面組織病理性形態結構改變，提高創面愈合率，提示大蒜素具有促進大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合的作用。

燒傷導致創面組織表皮細胞腫脹、毛細血管通透性增高而導致水腫，致使局部微循環障礙而影響創面愈合。創面組織中HYP可作為膠原含量檢測的標志物，能夠反映創面愈合程度。本研究發現：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著降低創面組織含水量、提高HYP含量，這可能是大蒜素促進大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合作用機制之一。

燒傷創面處于氧缺乏病理狀態，進而導致氧自由基（ROS）大量產生和過剩，機體內具有完整的ROS清除酶系統，其中SOD能夠將ROS還原成過氧化氫（H2O2），并在過氧化氫酶（CAT）作用下進一步還原生成水和氧[15]；MDA是ROS所致過氧化反應的終產物。所以，MDA含量及SOD、CAT活性能夠間接反映機體氧化應激損傷程度。本研究發現：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著降低創面組織MDA含量并提高SOD、CAT活性，這可能也是大蒜素促進大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合作用機制之一。

生長因子能夠促進細胞增殖與分化、合成與分泌多種創面愈合所需物質，從而表現出促進燒傷創面愈合的多種生理學功能[16]。EGF是一種由53個氨基酸組成的多肽類物質，具有促進表皮角質細胞、纖維細胞增殖的生理作用，并且能夠促進血管新生和核酸蛋白質合成[17]；b-FGF是一種由155個氨基酸組成的多肽，能夠促進細胞增殖、分化和遷移，并促進創面上皮組織生成[18]；劉川玉等[19]證實EGF和b-FGF對燒傷創面愈合具有重要促進作用。本研究發現：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著上調創面組織EGF、b-FGF蛋白表達，這可能也是大蒜素促進大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合的另一機制。

綜上所述，大蒜素具有促進大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合的作用，其機制可能與改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性而抑制氧化應激反應、提高HYP含量及上調EGF、b-FGF蛋白表達有關。