從“五臟相關”理論探討肝脾腎同治法抗大鼠免疫損傷性肝纖維化的機制?

劉 定 楊沈秋 張 禹△ 潘祥賓 黃秋思

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 150001）

肝纖維化是一種可逆的損傷愈合反應，其病理特征是肝星狀細胞（HSC）的激活和細胞外基質（ECM）的積累[1]。肝纖維化是慢性肝病進展為肝硬化的必經階段，目前西醫尚缺乏明確臨床用藥，因此，如何阻止肝纖維化進程具有重要意義。課題前期臨床研究[2-3]發現肝脾腎同治法具有抗肝纖維化作用。為進一步明確其對肝纖維化中關鍵環節HSC活化和ECM降解的影響，本研究通過觀察肝纖維化大鼠中核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、金屬蛋白酶組織抑制-1（TIMP-1）表達情況探討肝脾腎同治法抗肝纖維化的分子機制。

第一，不斷提升自身的知識文化修養和執政能力。地方政府官員是群眾中的精英，只有具備淵博的學識和高度的政治覺悟才能具有處理各種復雜問題的能力。因而作為官員要勤于學習，多讀書，多看報，多上網，了解我國傳統文化的主要內容，掌握馬克思列寧主義基本理論，懂得科學發展觀，熟練掌握地方政府的各項方針政策，依據上級指示嚴格要求自己。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠48只，雄性，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心提供，合格證號：SCXK（黑）2014-004，本實驗由黑龍江中醫藥大學倫理委員會批準，編號DXLL2015081001。所有動物自由飲水飲食，正常飼養適應環境7 d后開始實驗。

1.2 實驗藥物

肝脾腎同治法組方：柴胡10 g，白芍15 g，丹參30 g，莪術10 g，鱉甲25 g，黃芪30 g，淫羊藿15 g，白術20 g，茯苓15 g，甘草10 g。藥材由安徽晉仁中藥飲片有限責任公司提供，符合2015年版《中國藥典》相關規定，煎煮前浸泡2 h，鱉甲先煎2 h，再加入其他藥材加水煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，濃縮至生藥含量2.174 g/mL，置4℃冰箱備用。鱉甲煎丸（武漢中聯藥業，國藥準字號：Z42020772），主要成分：鱉甲膠、阿膠、炒蜂房、炒土鱉蟲、鼠婦蟲、蜣螂、大黃、桃仁、牡丹皮、射干、黃芩、柴胡、干姜、炒白芍、桂枝、葶藶子、石韋、姜厚樸、瞿麥、法半夏、硝石、黨參。臨用時研末以蒸餾水配制成混懸液，質量濃度為0.233 g/mL。

1.3 試劑與儀器

無菌豬血清由廣州鴻泉生物科技有限公司提供，批號20180101；NF-κB p65和α-SMA抗體由Wanleibo公司提供，批號分別為WL01273b和WL0002a；生物素化山羊抗兔IgG由碧云天公司提供，批號：A0277；辣根酶標記鏈霉親和素由碧云天公司提供，批號：A0303；大鼠TNF-α酶聯免疫分析（ELISA法）試劑盒由上海臥宏公司提供，批號：DZE30635；蘇木精、山羊血清由Solarbio公司提供，批號分別為H8070和SL2-10；TRNzol總RNA提取試劑由天根生化科技（北京）有限公司提供，批號：DP405-02。德國萊卡2135型切片機；Proline微量移液器；ELX-800酶標儀；美國moticam3000顯微攝影成像系統；DHG-9031A電熱恒溫箱；OLYMPUSDP73顯微鏡；Heal Force-NW10LVF超純水系統；Eppendorf-Centrifuge 5415D離心機；Applied Biosystems-ABI7500熒光定量PCR儀；美國Thermo-902-ULTS超低溫冰箱。

1.4 分組與造模

應用SPSS18.0統計軟件進行一般數據統計分析。計量資料以（）表示，計數資料比較采用成組設計資料的t檢驗，等級資料組間比較采用兩獨立樣本Mann-Whitney U秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.5 給藥方法

1.6.4 Real Time PCR檢測大鼠肝組織TIMP-1 mRNA表達 采用Trizol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，實驗操作按產品說明書進行，各樣品的目的基因（TIMP-1上游引物：ACAGCTTTCTGCAACTCGGA，TIMP-1下游引物：CAGCGTCGAATCCTTTGAGC）；和內參（ACTIN上游引物：CCTAAGGCCAACCGTGAAAA，ACTIN下游引物：GACCAGAGGCATACAGGGACA）分別進行Realtime PCR反應，每個樣本檢測3個復孔，數據采用2-ΔΔCT法進行分析。將所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應體系置于Realtime PCR儀上進行PCR反應。

1.6 標本采集與檢測

健康管理傳入中國后，國家政策給予了較大程度的支持，使得健康管理有了一定的發展。2016年8月，由中國醫藥新聞信息協會主辦，中國保健協會、中華醫學會健康管理學分會等單位支持的中國首屆精準健康管理高峰論壇暨精準健康管理分會成立大會在京召開。這次會議的召開標志著我國健康管理已經從經典的健康管理進入了精準健康管理的新高度。[8]精準健康管理是建立在個體基因檢測的基礎上，結合健康體檢尤其是免疫細胞功能檢測、健康檔案、生活方式、動態監測和大數據分析解讀等，對個體和不同人群提供精準健康評估、干預、督導、健康教育管理服務。精準健康管理時代的來臨無疑為構建中國特色的健康管理模式提供了新的思路和要求。[9]

終選結果早在我們的微信平臺（wine_mag）和10月專刊公布，這里就不多復制粘貼獲獎信息啦。而在10月19日，我們金樽獎在廣州康萊德酒店為獲獎的企業頒發了獎章。當然，少不了的還有金樽獎的系列主題活動！今年我們還搞了不少創新，像是以主賓國新西蘭為主題的葡萄酒產業論壇，當然必不可少的還有由金樽獎評審團主席David Allen MW主講，和專攻新西蘭產國的知名專家Sylvia劉玲擔綱翻譯的大師班！不過在此還是要對沒有搶到門票的小伙伴告個歉，活動的火爆程度超乎我們的想象，明年請繼續期待我們的金樽獎系列活動哦！

給藥結束后大鼠禁食不禁水12 h，然后用4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，解剖取出肝臟，沿肝臟長軸切取約2 mm厚的肝組織放入10%中性甲醛中固定，常規制備肝組織切片，切片厚度約5 μm；另外取大鼠左葉肝組織100 mg液氮速凍，-80℃保存；再取新鮮肝組織約500 mg，按1∶9加入冰生理鹽水，制成10%肝勻漿4℃，4 500 r/min離心15 min，取上清液分裝，-20℃保存。

1.6.2 免疫組化檢測大鼠肝組織NF-κB p65、α-SMA表達 包埋切片脫蠟至水，抗原修復，3%過氧化氫孵育，山羊血清封閉，一抗NF-κB p65、α-SMA孵育濕盒內4℃過夜，二抗濕盒內37℃孵育30 min。辣根酶標記，DAB顯色，蘇木素復染脫水、透明、封片，400倍鏡檢觀察蛋白表達，利用Image-Pro Plus（IPP）6.0圖像處理分析軟件分析陽性面積和累計光密度值，結果予以平均光密度（累計光密度值/陽性面積）進行統計分析。

人體正常吞咽功能由雙側大腦多處皮質及皮質下激活，而腦卒中后吞咽障礙患者的相關腦區則存在功能障礙[4] 。經顱直流電刺激法則可釋放微弱電流，并通過電極而使腦興奮，從而能改夠變腦中樞的興奮性，達到改善吞咽障礙的作用。綜上可見，針對腦卒中后吞咽功能障礙的患者，在給予常規康復訓練的基礎上，再聯合經顱直流電刺激法進行治療，效果較好，故值得推廣。

開始開藥，正常組、模型組給予生理鹽水6.7 mL/kg灌胃；肝脾腎同治組給予水煎劑6.7 mL/kg灌胃；鱉甲煎丸組給予鱉甲煎丸混懸液6.7 mL/kg灌胃。各組均每日1次，持續6周。

1.6.1 肝臟病理觀察 使用HE染色觀察大鼠肝臟病理學改變。Metavir評分系統[5]對肝組織病理分期進行分級。

1.7 統計學處理

將48只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、肝脾腎同治組、鱉甲煎丸組[4]，每組各12只。實驗動物適應性喂養1周后，除正常組外，其余3組使用未滅活的豬血清腹腔注射，固定時間為周二、周五上午9點，每次每只0.5 mL，每周兩次，連續注射8周。造模結束模型組隨機處死2只大鼠，取肝組織做HE染色，Metavir分期在F2以上證實造模成功[5]。

1.6.3 ELISA法檢測大鼠肝組織TNF-α表達 采用大鼠TNF-α酶聯免疫分析試劑盒，嚴格按照說明書流程操作，用空白孔調零，以標準品的濃度為橫坐標，調零后的吸光度（A值）為縱坐標，繪制標準曲線，利用標準曲線計算出待測樣品濃度。

2 結果

2.1 肝脾腎同治法對肝纖維化大鼠肝臟病理的影響

見圖1，表1。與正常組相比較，模型組Metavir分期顯著增高（P＜0.01），說明造模成功；與模型組相比較，鱉甲煎丸組和肝脾腎同治組Metavir分期顯著降低（P＜0.05），與鱉甲煎丸組相比較，肝脾腎同治組Metavir分期顯著降低（P＜0.05）。

圖1 各組肝組織病理切片（HE染色，200倍）

表1 各組大鼠Metavir肝臟纖維分期比較（n）

2.2 各組大鼠NF-κB p65、α-SMA蛋白表達比較

見圖2～圖3，表2。鏡下觀察以細胞核內和細胞質呈棕褐色改變為NF-κB p65、α-SMA蛋白陽性標記。與正常組比較，模型組NF-κB p65、α-SMA表達顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，肝脾腎同治組、鱉甲煎丸組NF-κB p65、α-SMA均明顯降低（P＜0.01）；與鱉甲煎丸組相比較，肝脾腎同治組NF-κB p65、α-SMA水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠NF-κB p65、α-SMA、TNF-α、TIMP-1 mRNA表達比較（±s）

表2 各組大鼠NF-κB p65、α-SMA、TNF-α、TIMP-1 mRNA表達比較（±s）

與正常組比較，?P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與鱉甲煎丸組比較，△P＜0.05

n組別正常組模型組肝脾腎同治組鱉甲煎丸組12 10 12 12 NF-κB p65 0.071±0.006 0.133±0.010*0.085±0.005#△0.095±0.013#α-SMA 0.053±0.007 0.121±0.014*0.087±0.010#△0.098±0.012#TNF-α（ng/L）110.28±11.55 171.57±10.24*125.13±9.63#△134.43±7.81#TIMP-1 mRNA 1.00±0.00 2.31±0.24*1.31±0.17#1.23±0.11#

2.3 各組大鼠TNF-α表達比較

圖2 各組NF-κB p65免疫組化（DAB染色，400倍）

圖3 各組α-SMA免疫組化（DAB染色，400倍）

見表2。ELISA法檢測結果顯示，模型組大鼠肝組織TNF-α水平顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）。肝脾腎同治組和鱉甲煎丸組TNF-α均顯著低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）。肝脾腎同治組TNF-α低于鱉甲煎丸組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠TIMP-1 mRNA表達比較

見表2。模型組與正常組比較，大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA的相對表達量顯著升高（P＜0.01）。鱉甲煎丸組、肝脾腎同治組與模型組比較，大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA的相對表達量均顯著降低（P＜0.01）。肝脾腎同治組與鱉甲煎丸組TIMP-1 mRNA的相對表達量相比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

?車宇彤、相妍:《就地城鎮化中的新型農村社區建設——以長春市三個典型村為例》，《勞動保障世界》2017年第5期。

3 討 論

肝纖維化根據其臨床表現可歸屬于“脅痛”“積聚”等范疇。本病病位在肝，與脾、腎關系密切，病機特點為“虛實夾雜”，其中正虛以肝、脾、腎虧虛為主，邪實以血瘀為要。中醫藏象學說認為五臟相關，疾病過程中，很可能反映了三臟甚至多臟系統之間的病理關系[6]。《素問·玉機真臟論》有云“五臟相通，移皆有次。五臟有病，則各傳其所勝……肝受氣于心，傳之于脾，氣舍于腎”，說明肝纖維化病位雖然在肝，在疾病進展過程中可傳變他臟，同時，其他臟腑功能失調亦可影響本臟，成為本病的病因或加重因素。從肝脾間關系來看，一方面，脾的運化功能有賴于肝氣的疏泄，《素問·寶命全形論》曰“土得木而達”。同時，肝的功能也有賴于脾胃滋養，《醫學衷中參西錄》中記載“肝多脾相助為理之臟也……實脾即所以理肝”。從肝腎間關系來看，肝與腎同居下焦，在五行生克關系上有母子相生關系，即母實則子壯，水涵則木榮。明代李中梓在《醫宗必讀·乙癸同源論》中明確提出“乙癸同源，腎肝同治”之說。研究發現疏肝健脾、補腎活血法具有一定抗纖維化作用[7-9]。結合“五臟相關”分析，機體內環境的穩態可以看作是臟腑間平衡的微觀體現，臟腑之間的平衡協調是機體維持正常生命活動的基礎。肝纖維化的發生也可以認為是這種平衡協調、整體統一遭到破壞的結果，因此肝脾腎同治就是旨在調整臟腑之間紊亂的狀態，以恢復機體內在環境的平衡。研究發現肌成纖維細胞是纖維化過程中產生ECM的主要效應細胞，而HSC是肝臟肌成纖維細胞的主要細胞來源之一，約占82%～96%[10]。HSC激活后，自分泌和旁分泌大量的TIMP-1，導致ECM的過度沉積[1]。越來越多的證據表明，NF-κB 可促進慢性炎癥的進展[11]，NF-κB信號被激活，導致其下游靶基因TNF-α在肝臟損傷過程中異常表達[12]，觸發炎癥級聯反應并進一步誘導受損肝細胞凋亡[13]。NF-κB和TNF-α之間的正反饋循環進一步加重了炎癥和肝損傷水平[14]，NF-κB的活化有助于活化的HSC生存[1]，而抑制NF-κB可以促進活化的HSC凋亡[15-16]。

本實驗結果表明，肝脾腎同治法能減少肝臟組織NF-κB、TNF-α、α-SMA、TIMP-1 mRNA的表達，提示肝脾腎同治法抗肝纖維化機制可能與減輕肝臟細胞周圍的炎癥環境，促進活化的HSC凋亡及ECM的降解有關。同時，研究結果發現肝脾腎同治組在Metavir肝纖維化分期，NF-κB、TNF-α、α-SMA表達上具有一定優勢，基于中藥多靶點藥物作用，尚需進一步實驗研究明確基于“五臟相關”理論的肝脾腎同治法在調節肝纖維化過程中重要相關分子及細胞平衡上的作用。