平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織Eotaxin和CCR3表達的影響?

王 玨 李竹英

（黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（哮喘）是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病，其發病機制復雜，具有較高的發病率及死亡率，已成為嚴重威脅人類健康的全球性疾病。流行病學顯示，目前全球患病率達到1%～18%，其中發達國家的哮喘發病率10%～30%，而我國則為0.5%～5%[1-2]。劉建秋教授是全國名老中醫學術經驗繼承工作指導老師，從事呼吸系統疾病臨床工作40余載，運用中醫藥治療呼吸系統疾病經驗豐富。在哮喘慢性持續期的治療中，劉教授認為“陽虛痰盛”乃其根本所在，故創立以“溫陽益氣，平喘化痰”為治法的中藥復方，研制成平喘顆粒。前期研究發現[3-5]，平喘顆粒可以通過抑制哮喘大鼠肺組織中EGF mRNA的表達，增加外泌體中miR-23b的含量，調控Notch/STAT信號通路等方式改善氣道重塑，但其減輕哮喘氣道炎癥的具體機制尚不明確。嗜酸性粒細胞（EOS）是與哮喘炎癥反應關系最為密切的效應細胞，可以通過釋放顆粒蛋白、生長因子和炎性介質等細胞因子引起哮喘的發生。EOS趨化因子（Eotaxin）和CC趨化因子受體3（CCR3）是EOS在肺內募集的主要調控者，Eotaxin通過與EOS表面上特異性受體CCR3結合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，特異性募集、趨化和激活EOS，導致大量的EOS在氣道上皮及肺內浸潤、聚集，從而誘導哮喘炎癥反應的發生[6]。本實驗通過觀察平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織中Eotaxin、CCR3表達的影響，探討平喘顆粒在治療哮喘炎癥方面的機制，為臨床應用平喘顆粒治療哮喘提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8周齡健康清潔級雌性BALB/c小鼠30只，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，體質量（20±2）g，飼養環境溫度（22±1）℃，濕度為45%～55%，自由進食飲水，適應性喂養1周后再開始實驗。

1.2 試藥與儀器 卵清蛋白（OVA）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A107820）；Giemsa染色液（南京建成生物工程研究所，D010）；Eotaxin抗體（abcam，Ab133604）；CCR3抗體（abcam，Ab32512）；內參抗體β-actin（santa cruz，sc-47778）；PVDF膜（密理博公司，IPVH00010）；Western及IP細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，P0013）；PMSF（上海碧云天生物技術有限公司，ST506）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，P0011）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司，P0015）。藥物：淫羊藿200 g，太子參 150 g，黃芪150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黃100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g。以上藥材加水煎煮2次，每2小時過濾1次，通過醇沉方式濃縮成稠膏[7]，相對密度為1.20～1.25（60℃），加入蔗糖、糊精適量制成1 000 g的顆粒劑，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制備，批號：20180723。按前期研究的最佳劑量（1.08 g/mL）含藥溶液灌胃，根據人體與動物的劑量折算，按照0.1 mL/10 g灌胃。超速冷凍離心機H-2050R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；-30℃恒冷低溫切片機CM69001，德國 Leica；水平搖床 WD-9405B、電泳儀DYY-7C、轉移槽DYCZ-40D和凝膠成像系統WD-9413B，北京六一儀器廠；超聲霧化機NB-150 U，歐姆龍自動化（中國）有限公司；-70℃超低溫冰箱DW HL-668，中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 分組與造模 30只BALB/c小鼠，隨機分為3組，每組10只，分別是對照組、哮喘模型組、哮喘+平喘顆粒組。哮喘小鼠模型建立：根據文獻方法，應用OVA致敏液[100 μg OVA+1 mg Al（OH）3]激發 BALB/c小鼠，制備慢性哮喘小鼠模型。于實驗第1日、14日給予小鼠腹腔注射0.2 mL致敏液，22 d后進行霧化激發，霧化吸入1%OVA溶液，每次30 min，每周進行3次，連續激發8周[8]。

1.4 干預方法 各組實驗動物分別進行對應處理：對照組腹腔注射及霧化吸入等體積生理鹽水代替OVA激發；哮喘模型組、哮喘+平喘顆粒組造成慢性哮喘動物模型。從第1次霧化激發的當天開始，哮喘+平喘顆粒組每天灌胃給予平喘顆粒藥液0.1 mL/10 g，持續給藥8周，激發階段則每次激發前1 h灌胃；對照組和哮喘模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，灌胃時間同哮喘+平喘顆粒組。

1.5 標本采集與檢測 各組小鼠末次激發24 h后處死，向主氣管注射無菌生理鹽水0.5 mL，抽吸3次后將抽出的肺泡灌洗液（BALF）收集在1.5 mL離心管中備用。開胸取小鼠右肺的前葉及中葉部分，用液氮凍存后轉入-70℃超低溫冰箱中保存，以備Western blotting檢測。1）BALF中EOS數量測定：將回收的BALF在1 h內于1 000×g，4℃離心，分離上清液，沉淀稀釋后制備細胞涂片，行瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡下計數200個細胞中EOS的數量，重復計數3次。2）Western blotting檢測：取凍存于-70℃的各組小鼠右肺的前葉及中葉部分，把組織切成非常細小的碎片，經蛋白質抽提、裂解、離心，提取小鼠肺組織總蛋白進行蛋白質定量，按BCA蛋白試劑盒說明操作以檢測蛋白濃度，酶標儀570 nm波長濾光片進行讀數，記錄數據。以標準蛋白濃度及對應吸光值繪制標準曲線，并通過回歸方程計算樣本蛋白濃度，并乘以稀釋倍數，即為樣本的蛋白濃度。凝膠電泳、轉膜后用TBST緩沖液洗滌5 min，再浸入5%脫脂奶粉溶液中，緩慢搖動1 h后進行封閉及抗體孵育。孵育二抗后的PVDF膜繼續用TBST緩沖液洗滌6次，每次5 min。將化學發光試劑A、B等體積混合，均勻滴注于PVDF膜上，靜置反應5 min，然后轉入暗盒中進行曝光。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠的一般狀態 對照組小鼠毛發有光澤，反應靈敏、活躍，食量、體質量逐漸增加；呼吸頻率平穩。哮喘模型組小鼠哮喘激發開始后，出現喘息、咳嗽癥狀，霧化激發時明顯，在不激發時也有咳嗽癥狀。隨著激發次數增多小鼠出現毛發蓬松、煩躁不安，活動減少，食量下降，體質量增加緩慢。哮喘+平喘顆粒組小鼠用平喘顆粒干預后喘息、咳嗽癥狀較哮喘模型組輕，毛發有光澤，倦怠；食量較對照組少，但較哮喘模型組多；體質量在干預前增加緩慢，干預后增加明顯。

2.2 各組小鼠BALF中EOS計數比較 見表1。與對照組比較，哮喘模型組和哮喘+平喘顆粒組小鼠BALF中EOS計數增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。與哮喘模型組比較，哮喘+平喘顆粒組小鼠BALF中EOS計數減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠BALF中EOS計數比較（×104/mL，±s）

表1 各組小鼠BALF中EOS計數比較（×104/mL，±s）

與對照組比較，△P＜0.05；與哮喘模型組比較，?P＜0.05。下同

組別對照組哮喘模型組哮喘＋平喘顆粒組n 10 10 10 EOS計數0.05±0.01 3.84±0.85△1.85±0.58△*

2.3 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達比較見表2，圖1。與對照組比較，哮喘模型組和哮喘+平喘顆粒組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與哮喘模型組比較，哮喘+平喘顆粒組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達比較（±s）

組別對照組哮喘模型組哮喘＋平喘顆粒組n 10 10 10 Eotaxin 1.02±0.37 3.40±0.35△2.29±0.37△*CCR3 0.91±0.41 3.73±0.56△2.02±0.22△*

3 討 論

圖1 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白的表達

哮喘是一種由遺傳因素和環境因素共同作用所致的慢性氣道炎癥性疾病，其發病機制復雜，尚未完全闡明。哮喘發病過程中常伴隨著多種炎性細胞、細胞因子及炎性介質的參與，其中EOS的地位至關重要。氣道炎癥是哮喘的病理變化基礎，其主要表現為EOS的浸潤、活化及其導致的氣道高反應。EOS活化后可以釋放大量的堿基蛋白、過氧化酶、陽離子蛋白等顆粒產物，這些顆粒產物具有很強的細胞毒性作用，可以引起氣道上皮組織水腫、脫落和壞死，血管通透性增高，黏液分泌增多等病理改變，產生氣道慢性炎癥和氣道的高反應性，導致哮喘的發作[9]。EOS能夠激活機體內其他的炎癥細胞，如巨噬細胞、淋巴細胞等，并且可以刺激EOS本身，促進多種炎性介質的釋放，介導氣道內的炎癥反應，導致哮喘的發生[10]。Eotaxin是一種選擇性的EOS趨化劑，對EOS有特異性的趨化作用，可以誘導EOS細胞質肌動蛋白多聚化，吸引EOS向炎癥部位募集，黏附于內皮細胞上，而對其他白細胞作用較弱，明顯區別于其他趨化因子。同時，Eotaxin還是一種有效的EOS激活劑，能夠激活EOS呼吸爆發并釋放氧自由基，促使EOS脫顆粒，釋放白三烯和組胺，從而導致氣道的炎癥反應和高反應性。研究顯示，哮喘小鼠外周血和肺組織中Eotaxin表達增強，其表達強度與BALF中EOS計數和哮喘的嚴重程度呈正相關性，提示Eotaxin參與EOS的募集過程及其引起的炎癥反應[11]。CCR3是一種表達于EOS上的受體蛋白，并且是Eotaxin的唯一受體。研究證實，Eotaxin對EOS的趨化作用95%是通過CCR3介導產生的[12]。CCR3還可以激活Th2類細胞，促進相關炎性因子的釋放，引發氣道炎癥。王濤等[13]研究發現CCR3拮抗劑SB2328437可以通過抑制哮喘小鼠氣道中CCR3和炎癥細胞的結合，下調BALF中IL4、TNF-α的表達水平，抑制氣道炎癥細胞浸潤，從而減輕哮喘的氣道炎癥反應。Eotaxin與CCR3特異性結合，可以產生一系列的信號通路傳導和轉錄蛋白激活等生化反應，選擇性地促進EOS向氣道黏膜遷移、聚集，進而誘導氣道炎癥反應的發生。李小波等[14]研究顯示Eotaxin通過與其受體CCR3結合可以促進CD34+細胞向EOS的分化，同時趨化EOS向外周血和支氣管黏膜聚集、浸潤，短期內EOS急劇增加，引起支氣管平滑肌痙攣、氣管微血管通透性增加等反應，從而誘導哮喘氣道炎癥的發生。研究顯示，哮喘小鼠肺組織中Eotaxin、CCR3呈高表達狀態，并且在這種高表達狀態下，骨髓釋放的EOS和向外周血、肺組織遷移的EOS數目均明顯增多，提示Eotaxin、CCR3在EOS的活化、分化、趨化中發揮重要作用[15-16]。

平喘顆粒是黑龍江中醫藥大學自制的中藥制劑，由淫羊藿、太子參、黃芪、五味子、知母、炙麻黃、款冬花、罌粟殼、地龍組成。方中淫羊藿、炙麻黃共為君藥，具有溫補腎陽、宣肺平喘之功；黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍共為臣藥，具有益氣助陽、潤肺生津、止咳平喘之功；罌粟殼斂肺止咳，為方中之佐藥；知母潤肺止咳，引方中諸藥歸經，為方中之使藥。諸藥合用使腎陽得補，脾氣得健，肺氣得以宣暢，共奏溫陽益氣、化痰平喘之效。研究發現，淫羊藿可以通過下調EOS表面的CCR3 mRNA的表達，降低哮喘大鼠肺組織中Eotaxin的表達，抑制EOS的趨化反應性，減輕EOS在氣道浸潤的嚴重程度，改善哮喘癥狀[17]。李中燕等[18]研究發現麻黃的主要成分麻黃堿可以通過抑制支氣管上皮細胞的Eotaxin表達減輕哮喘的炎癥反應。蔡萃等[19]研究發現，黃芪的主要活性成分黃芪甲苷可以通過降低哮喘小鼠血清中趨化因子Eotaxin的濃度和肺組織中CCR3及其mRNA的表達，抑制氣道中EOS的聚集，從而減輕哮喘小鼠肺組織的炎性損傷。

本實驗中我們應用OVA致敏液制備慢性哮喘小鼠模型，哮喘模型組小鼠出現喘息、咳嗽、毛發蓬松、煩躁不安、活動減少等哮喘樣癥狀；且BALF中EOS計數增多；表明哮喘模型制備成功。研究結果顯示，平喘顆粒可以減少哮喘小鼠BALF中EOS計數，改善哮喘的炎癥反應。鑒于Eotaxin、CCR3在EOS的趨化反應中的重要作用，本實驗觀察了平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織中Eotaxin、CCR3蛋白表達的影響，結果顯示平喘顆粒可以抑制肺組織中Eotaxin、CCR3蛋白的表達。綜上所述，平喘顆粒治療哮喘炎癥的作用機制可能與降低肺組織中Eotaxin、CCR3蛋白的表達，從而抑制EOS向氣道的聚集浸潤有關。