麻杏解毒合劑治療新冠肺炎分子機制的網絡藥理學研究?

易國祥 付 玉 李延萍 吳 斌 王守富

（重慶市中醫院，重慶 400021）

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）臨床以發熱、乏力、干咳為主要臨床癥狀，有特征性影像學改變，部分患者發生嚴重急性呼吸道感染、呼吸衰竭等并發癥[1]。中醫藥治療新冠肺炎在疫情防控中發揮了重大作用。重慶市中醫院根據新冠肺炎的病因病機，總結臨床診治經驗，擬定了麻杏解毒合劑，全方由麻黃、杏仁、石膏、浙貝母、蟬蛻、僵蠶、桔梗等藥物組成，具有辛涼宣肺平喘、解毒清肺化濁的功效，治療新冠肺炎早期邪熱壅肺，證見發熱、咳嗽、痰少、氣喘、胸悶等。麻杏解毒合劑在重慶市抗擊新冠肺炎疫情中取得了良好的療效，現已獲批院內制劑。本文擬通過網絡藥理學方法分析該復方的分子機理，為后續的機制研究提供參考。

1 研究方法

1.1 麻杏解毒合劑活性成分信息收集 在TCMSP[2]數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索麻杏解毒合劑11味中藥的活性成分，設置篩選閾值：口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。

1.2 活性成分靶點預測 提取麻杏解毒合劑11味中藥的活性成分的分子ID，通過分子ID在TCMSP數據庫檢索對應的藥物靶點信息。

1.3 疾病靶點的預測 GeneCards數據庫[3]（http：//www.genecards.org/）可以提供已知或正在探索的基因信息。以“Viral pneumonia”為關鍵詞進行捜索，收集與病毒性肺炎相關的基因靶點。

1.4 交集靶點的獲取 結合GeneCards數據庫建立的疾病靶點，應用 Venny 2.1[4]（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲取麻杏解毒合劑活性成分靶點與疾病靶點的交集，作為麻杏解毒合劑治療病毒性肺炎的靶點分析。

1.5 網絡構建 將獲得的交集靶基因導入String10[5]（https：//string-db.org/），構建蛋白質-蛋白質互作（PPI）網絡，再將文本數據導入Cytoscape[6]中構建麻杏解毒合劑的可視化靶點PPI網絡，在網絡中篩選出起調控作用的關鍵蛋白。

1.6 網絡分析 使用David[7]在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov/）對交集靶點基因的GO生物學過程（GOBP）和KEGG通路（KEGG Pathway）進行富集分析，并以P=0.05作為顯著功能與通路的臨界值。

2 結 果

2.1 活性成分的篩選與靶點預測結果 根據TCMSP平臺中OB和DL的界定值篩選，從麻杏解毒合劑9味中藥（數據庫未收錄石膏、僵蠶）中篩選出92個候選活性成分，其中麻黃23個、杏仁19個、浙貝母7個、蟬蛻8個、姜黃3個、桔梗7個、枳殼5個、草果8個、豆蔻12個。92個候選活性成分對應1 199個作用靶點。

2.2 疾病靶點預測結果 通過GeneCards數據庫檢索“Viral pneumonia”，共得到3 473個相關基因。以“Score＞5”為條件進行篩選，滿足條件的有971個，以此作為疾病候選靶點基因。

2.3 活性成分-疾病交集靶點結果 應用Venny 2.1在線軟件對92個有效成分的1 199個作用靶點與病毒性肺炎的971個疾病靶點取交集，獲得52個交集靶點，見圖1。

圖1 活性成分—疾病交集靶點Venny圖

2.4 成分-靶點-疾病相互作用網絡構建 采用Cytoscape 3.3.0軟件，對中藥、活性成分、病毒性肺炎及交集靶點構建活性成分-靶點-疾病網絡。在互作網絡中，包括154個節點（9味中藥、92個化合物節點、52個靶點和1個疾病節點）和947條邊，見圖2。其中，1個節點的度（Degree）表示網絡中和節點相連的線路數。根據Degree由大到小排序，選取前30位，結果見表1。有28個活性成分作用靶點Degree≥10個，提示這些活性成分在整個網絡中起樞紐作用。

圖2 中藥-成分-靶點-疾病互作網絡圖

表1 中藥-成分-靶點-疾病節點Degree值

2.5 麻杏解毒合劑靶點PPI網絡的構建與分析 將藥物與疾病的52個交集靶點運用String數據庫建立麻杏解毒合劑靶點蛋白相互（PPI）網絡。取評分值高于0.9，置信度最高的數據，隱藏散點值制作PPI網絡圖，見圖3A。顯示該網絡涉及52個蛋白質節點和92條連線，平均節點的度為3.54，平均局部聚類系數0.341（P＜1.0～16）。用節點的大小和顏色表示Degree值，節點越大對應的Degree值越大，顏色由紅變藍對應的Degree值也越大；用邊的粗細表示Combine score值的大小，邊越粗，Combine score值越大。根據Degree≥20的節點制作出前30個關鍵蛋白節點的條形圖，如JUN、MAKP1、MAKP8、APP、ESR1、IL-6等，見圖3B，提示這些關鍵蛋白是網絡的核心靶點。

圖3 麻杏解毒合劑-病毒肺炎交集靶點蛋白PPI網絡

2.6 GO富集與KEGG通路富集分析 將52個交集靶基因導入DAVID在線軟件進行GO富集分析，麻杏解毒合劑在體內通過調節52個潛在靶點基因，進而調控48個生物過程，包括氧化應激反應（response to oxidative stress）、缺氧反應（response to hypoxia）、基因表達負調控（negative regulation of gene expression）、血壓調節（regulation of blood pressure）、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調控（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter）、T細胞增殖正調控（positive regulation of T cell proliferation）等，見圖4。

圖4 GO富集圖

KEGG通路富集分析發現麻杏解毒合劑的靶點主要富集在69條信號通路上，其中感染相關通路16條，如Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、甲型流感（Influenza A）、單純皰疹感染（Herpes simplex infection）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）等。免疫炎癥相關7條，如Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）等。神經內分泌12條，如心肌細胞的腎上腺素信號傳導（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、多巴胺能突觸（Dopaminergic synapse）等。細胞功能通路11條，如ErbB信號通路（ErbB signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）等。疾病相關通路22條，如癌癥通路（Pathways in cancer）、炎性腸病（Inflammatory bowel disease）等。KEGG通路富集的Pathway富集柱狀圖見圖5。

圖5 部分KEGG通路富集圖

3 討 論

3.1 麻杏解毒合劑與新冠肺炎 新冠肺炎是一種由病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，發病迅速，傳播很快。根據新冠肺炎流行病學特點，歸屬于中醫學“疫毒”“疫癘”“瘟疫”“溫疫”“濕毒疫”等范疇[8-9]。病因為感受“疫癘”之邪，從口鼻而入，首先犯肺，病位在肺；關于病性，不同地區、學者有不同看法，如“寒濕疫”“濕毒疫”“濕疫”等[10]。麻杏解毒合劑是以麻杏石甘湯和升降散化裁而成，方中麻杏石甘湯辛涼宣泄，清肺平喘，用于外感風寒郁而化熱，熱壅于肺；升降散升清降濁，散風清熱，治溫病表里三焦之大熱。因甘草滋膩礙邪，大黃苦寒瀉下傷正氣，故去甘草、大黃；加桔梗、浙貝母宣肺化痰，草果、豆蔻溫中化濁，共奏辛涼宣肺平喘、解毒清肺化濁之功。麻杏解毒合劑為重慶市新冠肺炎中醫診療方案推薦的代表方劑。

3.2 麻杏解毒合劑的核心靶點和功能 從表1可見麻黃、豆蔻、草果在中藥-成分-靶點-疾病網絡中的Degree值最高，表明這3味中藥的核心作用。在藥物與疾病的52個交集靶點中，如圖3所示，JUN、MAPK1、MAPK8、APP、ESR1、IL-6、EGFR、MAPK14、VEGFA等關鍵靶點，其功能涉氧化應激反應、缺氧反應等。與炎癥細胞因子調控相關的MAPK14，NOS2等，總共涉及48個生物過程（見圖4），均與疾病、藥物靶點密切相關。如有研究發現，麻杏石甘湯能降低重癥肺炎患者的炎性反應，改善呼吸功能，減緩病情進展[11]。升降散對膿毒癥患者心臟有保護作用，這種保護作用的機制可能與提高抗氧化能力有關[12]。

3.3 麻杏解毒合劑與信號通路 如圖5所示，KEGG通路富集了麻杏解毒合劑69條通路，首先是與感染相關通路，如EB病毒感染、甲型流感等。新冠肺炎易誘發低氧血癥，HIF-1信號通路在機體對低氧濃度或缺氧應答中至關重要，在缺氧條件下充當了許多缺氧誘導基因的主要調節因子，不僅可以通過降低氧氣利用率，而且還可以通過其他刺激物（如一氧化氮或各種生長因子）來誘導一系列的適應性反應[13]。在動物實驗中，麻杏石甘湯對流感病毒致感染鼠肺部炎癥引起的肺泡、細支氣管等正常組織結構有明顯的改善作用[14]。其次則是與免疫炎癥相關通路，如Toll樣受體和NOD樣受體信號通路均為固有免疫。作為機體抵抗病原微生物的第一道防線，固有免疫細胞通過模式識別受體識別病原體相關模式分子繼而啟動下游信號通路，以發揮固有免疫效應，清除入侵的病原體[15-16]。當NOD樣受體及Toll樣受體信號通路被刺激后可激活干擾素信號通路，進而激動T細胞、B細胞受體信號通路，調動適應性免疫，產生大量的細胞因子[17-18]。通過TNF和NF-κB信號通路的放大作用[19]，Rap1信號通路介入了急性肺損傷[20]。此外，還有與神經內分泌信號相關通路，如調動了腎上腺素信號傳導、多巴胺能突觸信號等功能。最后，還有與細胞功能通路和疾病相關通路，如參與細胞增殖、分化、轉化、凋亡等的MAPK信號通路；與癌癥、炎性腸病、類風濕等疾病相關通路等。從上述信號通路可推測，麻杏解毒合劑能改善呼吸功能，提高低氧的適應性反應，調動固有和適應性免疫，減少炎癥反應對組織的損傷，同時也影響著細胞的多方面生理功能，參與多種疾病的干預作用。

綜上所述，本文借助網絡藥理學方法探討了麻杏解毒合劑治療新冠肺炎的可能機制，為下一步研究提供了思路。本研究也存在著一些不足，一方面盡管筆者檢索了多個數據庫，但均未檢索到石膏和僵蠶的活性成分，尤其石膏是本處方的重要藥物，因此對結果會有一定的影響；另一方面因為新冠肺炎是一種新的疾病，現數據庫還未收錄該疾病的相關靶點，所以本研究選擇了病毒性肺炎的靶點來開展研究。