內源性大麻素N-花生四烯酸氨基乙醇介導卵巢癌細胞自噬和內質網應激*

黃靜瑩， 陳萱， 饒靖紅

內源性大麻素花生四烯酸氨基乙醇介導卵巢癌細胞自噬和內質網應激*

黃靜瑩△， 陳萱， 饒靖紅

（福建醫科大學附屬泉州第一醫院婦產科，福建 泉州 362000）

探討內源性大麻素-花生四烯酸氨基乙醇（AEA）在卵巢癌中的作用，并深入研究其作用機制。ELISA實驗分析健康對照組和卵巢癌組患者血清中AEA的水平，并結合ROC曲線評估AEA對卵巢癌患者的診斷價值；結合CCK-8實驗、Transwell小室侵襲實驗和劃痕實驗檢測AEA對卵巢癌細胞活性、遷移和侵襲的影響；并通過腫瘤體積、瘤重的測量及瘤組織肉眼觀圖進一步驗證AEA對卵巢癌的作用；同時用流式細胞術和Western blot檢測AEA對卵巢癌細胞凋亡的影響，進而采用Western blot檢測卵巢癌細胞自噬及內質網應激相關蛋白的水平，探究其促進卵巢癌細胞凋亡的機制。卵巢癌患者體內AEA的含量較健康對照組顯著下降， ROC結果提示AEA有望成為區分卵巢癌患者和健康個體的靈敏性生物學標志物，且AEA可以抑制卵巢癌細胞的活力、遷移、侵襲，抑制卵巢癌組織生長。AEA通過促進卵巢癌細胞內質網應激并影響其自噬，進而促進卵巢癌細胞凋亡。

內源性大麻素；-花生四烯酸氨基乙醇；卵巢癌；自噬；內質網應激

卵巢癌是女性生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一［1］。全球每年有24萬名女性被診斷出患有卵巢癌，且5年生存率低于45％，成為女性中第7位最常見的腫瘤和第8位最常見的腫瘤死因［2］。卵巢癌在常規治療手段后，由于化療耐藥等原因致使復發率和死亡率極高，嚴重威脅患者的生命［3］。因此尋找新的治療手段提高卵巢癌患者的生存期刻不容緩。

內源性大麻素系統是一種脂質信號系統，涉及廣泛的生理和病理過程，如能量代謝和炎癥［4-5］。內源性大麻素系統有3個主要成分：內源性大麻素、大麻素受體和內源性大麻素代謝物［4］。研究表明-花生四烯酸氨基乙醇（-arachidonic acid aminoethanol， AEA）是一種重要的天然存在的內源性大麻素，其能通過激動大麻素受體CB1和CB2，從而對肥胖、炎癥、疼痛和化療引起的惡心或嘔吐起抑制作用，并可以減輕神經變性疾病和多發性硬化癥的癥狀［6-7］。另外，AEA還有較強的抗腫瘤作用［8- 9］，可作為化療劑用于腫瘤治療，但其在卵巢癌中的作用仍不甚明確。

細胞自噬作為維持內穩態的一種常見機制，其可以通過清除受損的蛋白質和老化的細胞器維持細胞內環境的穩態［10］。腫瘤病理生理學的特征在于細胞遺傳和代謝組成病變，而自噬將代謝物傳感與蛋白質降解及生物能量效率聯系起來，與腫瘤的發生發展及治療關系密切［11］。研究發現，多數抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞凋亡的過程受自噬的影響［10］，然而這種自噬是否有助于AEA的抗腫瘤作用仍不清楚。另外，內質網應激（endoplasmic reticulum stress， ERS）與自噬密切相關，可以與自噬協同作用影響腫瘤細胞的生存［12-13］。本課題中將探討AEA對卵巢癌的治療作用，并進一步揭示自噬和內質網應激是否參與AEA的抗腫瘤作用，為將AEA應用于卵巢癌的治療打下堅實的實驗基礎。

材料和方法

1　材料

1.1細胞株和動物人卵巢癌OVCAR3細胞購自中國科學院上海生命科學研究院。4~6周齡C57BL/6J雄性小鼠6只，體重16~18 g， SPF級，購自南京大學模式動物中心，許可證號為SCXK（蘇）2017-0007。

1.2試劑AEA購自Sigma； CCK-8試劑盒購自Progma；抗ATG5、BECN1、P62和LC3B-Ⅱ單克隆抗體購自Abcam；抗cleaved caspase-3、caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose） polymerase，PARP］和cleaved PARP多克隆抗體購自Santa Cruz；Ⅱ抗及Western blot相關化學試劑購自武漢飛羿技術公司； ECL發光液購自Pierce；胎牛血清購自杭州四季青公司； RPMI-1640培養基購自Gibco； Annexin V PE-7AAD凋亡試劑盒購自BD Biosciences。

1.3臨床樣本收集本研究于2016年2月~2018年12月期間從福建醫科大學附屬泉州第一醫院招募了15例診斷為卵巢癌的患者，平均年齡為38.5歲。此外，同時招募15例健康志愿者作為對照組，平均年齡為39.3歲。研究方案經福建醫科大學附屬泉州第一醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者均提供知情同意書。在研究開始之前，未對患者進行系統治療，也未使用免疫抑制劑。

2　方法

2.1動物的分組和處置所有C57BL/6J小鼠隨機分為：PBS對照（control，CON）組，共3只，僅皮下種植OVCAR3細胞，每只種植1×106個細胞，種植后第4天起每2日瘤周注射PBS； AEA治療組，共3只，皮下種植OVCAR3細胞，每只種植1×106細胞，種植后第4天起每2日瘤周注射AEA（每只每次10 μmol/L）。在第32天處死小鼠，取腫瘤組織拍照，并經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續切片（玻片事先用多聚賴氨酸處理）。

2.2OVCAR3細胞的培養OVCAR3細胞為貼壁生長細胞，使用含10%的胎牛血清的高糖DMEM培養基，培養于37℃、含5% CO2的孵箱中，每2 d傳代1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。

2.3Western blot實驗使用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，將完成定量的樣品上樣到聚丙烯酰胺凝膠中，上樣量40 μg，開始電泳，電泳結束轉膜至PVDF膜。將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，封閉結束后孵育 I 抗過夜，再加入所需Ⅱ抗孵育，最后通過ECL化學發光顯影及曝光。

2.4Transwell小室侵襲實驗用BD公司的Matrigel以1∶8稀釋，包被Transwell小室底部膜上室面，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠。在小室下方加入含20%胎牛血清的DMEM 600 μL，小室上方接種無血清DMEM稀釋的OVCAR3細胞2×104個，培養24 h后，吸干上室面液體，并轉移到含有800 μL 4%多聚甲醛的24孔細胞培養板中，室溫固定15 min后，用結晶紫室溫染色15 min，使用ddH2O沖洗小室3次后，用棉棒輕輕擦干，待其晾干后于顯微鏡下隨機挑選5個視野，計算穿膜細胞數。

2.5病理變化的觀察采用相鄰切片作常規HE染色，觀察皮下卵巢癌組織病理改變，估計AEA對卵巢癌的治療效果。

2.6CCK-8法檢測細胞活力取對數生長期OVCAR3細胞鋪96孔板，每孔4 000個細胞，在其貼壁生長后，每組10孔每孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續培養4 h，并在酶標儀上450 nm處測定吸光度（）值，以相對應的吸光度值繪制生長曲線。重復3次。

2.7劃痕實驗檢測細胞的遷移能力取OVCAR3細胞對數生長期時鋪6孔板，每孔2×106細胞，置于培養箱中，待其貼壁生長并密度合適后，用槍頭在每孔正中間畫線，并用PBS沖洗，洗去劃痕中間死亡的細胞，并將培養基換成無血清培養基。分別在0 h和48 h拍照。

2.8雙染法檢測細胞凋亡取處理完的OVCAR3細胞用胰蛋白酶消化， 1 200 r/min離心3 min，用4℃預冷的無菌PBS漂洗2次，每次5 min，調整細胞濃度為2×108/L，在200 μL的細胞懸液中加入10 μL的Annexin V-FITC，然后加入10 μL（20 mg/L）PI，室溫避光孵育10 min，加入500 μL的PBS，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

3　統計學處理

所有統計分析均用SPSS 19.0軟件完成。各組檢測結果用均數±標準差（mean±SD）表示，兩組組間比較用檢驗；多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組均數間的兩兩比較采用LSD-檢驗；兩變量之間相互關系用Pearson線性相關分析，計算相關系數。以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　卵巢癌患者體內血清N-花生四烯酸氨基乙醇水平下調

采用ELASA實驗檢測15名卵巢癌患者及15名健康對照組成員體內血清AEA的水平，結果如圖1A所示，與相對應的健康對照組成員血清AEA的水平相比，卵巢癌患者血清AEA的水平顯著降低（<0.01）。隨后，運用ROC曲線區分卵巢癌患者和對照組成員以評估AEA對卵巢癌患者的診斷價值，結果顯示， AEA的曲線下面積為0.838（圖1B），提示AEA有望成為區分卵巢癌患者和健康個體的靈敏性生物學標志物。

Figure 1.　AEA was down-regulated in ovarian cancer. A: the serum level of AEA in the ovarian cancer patients and normal control （NC） individuals； B: ROC analysis based on the levels of AEA. Mean ±SD. n=15. **P<0.01 vs NC group.

2　N-花生四烯酸氨基乙醇抑制OVCAR3卵巢癌細胞的活性

為進一步探討AEA對卵巢癌的影響，本研究首先檢測AEA對卵巢癌細胞的生長、遷移和侵襲的影響。分別使用0、5、10和20 μmol/L的AEA處理OVCAR3細胞24 h后，CCK-8實驗檢測結果顯示，與正常對照組比較，AEA各劑量組卵巢癌細胞的生存率顯著降低（<0.01），見圖2A。而Transwell小室侵襲實驗結果顯示，AEA各劑量組的侵襲能力顯著降低，且降低程度呈一定劑量依賴性，見圖2B。劃痕實驗結果表明，AEA明顯減弱卵巢癌細胞的遷移能力，見圖2C。以上結果顯示，AEA對卵巢癌細胞的活力、遷移和侵襲能力有一定抑制作用。

Figure 2.　AEA inhibited the viability, invasion and migration of OVCAR3 ovarian cancer cell. A: CCK-8 assay was used to detect the growth curve of ovarian cancer cells treated with AEA at 0, 5, 10 and 20 μmol/L; B: Transwell assay was used to measure the ability of invasion in 4 groups of cells (×100); C: the Scratch test was used to detect the migration ability of 4 groups of cells (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA group.

3　N-花生四烯酸氨基乙醇促進OVCAR3卵巢癌細胞凋亡

通過Western blot實驗檢測不同濃度AEA處理24 h后凋亡相關蛋白caspase-3及其剪切體cleaved caspase-3，PARP及其剪切體cleaved PARP的蛋白水平，與對照組相比，不同濃度AEA處理OVCAR3細胞后cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明顯升高，而caspase-3和PARP變化的差異無統計學顯著性（圖3A），提示AEA促進OVCAR3細胞凋亡發生。流式細胞術的分析結果也進一步佐證上述實驗結果，表明各劑量AEA可引起卵巢癌細胞凋亡率增加（圖3B）。上述實驗提示AEA可以誘導卵巢癌細胞凋亡，從而對卵巢癌起抑制作用。

Figure 3.　AEA promote the apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells. A: the protein levels of apoptosis-related molecules caspase-3, cleaved caspase-3, PARP and cleaved PARP in the 4 groups; B： flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA group.

4　N-花生四烯酸氨基乙醇的抗腫瘤效果

為明確AEA對卵巢癌的治療作用，我們在小鼠皮下接種OVCAR3卵巢癌細胞，待其長到合適大小后開始瘤周給藥，每4 d檢測腫瘤體積，結果顯示，與對照組相比，AEA給藥后可有效抑制腫瘤生長速度，腫瘤體積明顯縮小，瘤重顯著減輕（<0.05），見圖4。動物實驗結果提示AEA具有顯著抗腫瘤效果，可能成為卵巢癌治療的新藥物。

Figure 4.　AEA inhibited the tumor growth, and the tumor volume (A), gross view of mouse tumor tissues (B) and tumor weight (C) of the mice were observed. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs CON group.

5　N-花生四烯酸氨基乙醇誘導卵巢癌細胞自噬

5、10和20 μmol/L的AEA處理卵巢癌細胞時，除了凋亡蛋白表達發生變化以外，自噬相關蛋白ATG5、BECN1、P62和LC3B-Ⅱ表達水平也發生了變化，如圖5所示，用各劑量的AEA處理24 h后，用Western blot法檢測發現隨著AEA劑量增加，卵巢癌細胞自噬相關蛋白ATG5、BECN1和LC3B-Ⅱ表達增加，P62蛋白表達減少（<0.01），見圖5A。在腫瘤組織中也發現，與對照組相比，使用AEA治療后，小鼠腫瘤組織的自噬相關蛋白表達與OVCAR3細胞有相同變化（<0.01），見圖5B。上述結果表明AEA可以誘導卵巢癌細胞自噬。

Figure 5.　AEA promoted autophagy in ovarian cancer cells. A: the expression of autophagy related proteins in the OVCAR3 ovarian cancer cells were detected by Western blot; B: the expression of autophagy related proteins in the xenografted tumors of the animals were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA grpup; #P<0.05, ##P<0.01 vs CONgroup.

6　N-花生四烯酸氨基乙醇誘導卵巢癌細胞內質網應激

鑒于內質網應激與自噬的密切關系，本研究探究是否同時影響內質網應激反應。我們分別使用0、5、10和20 μmol/L的AEA處理OVCAR3細胞24 h，利用Western blot檢測內質網應激相關蛋白的表達變化，結果顯示AEA處理后可以上調PERK、eIF2α和CHOP等內質網應激相關蛋白的水平（<0.01），見圖6A。同時AEA還可以提高IRE1α和ATF6α蛋白的水平（<0.01），見圖6B。以上結果說明AEA可以誘導卵巢癌細胞發生內質網應激。

Figure 6.　AEA promoted endoplasmic reticulum stress in the OVCAR3 ovarian cancer cells. The expression levels of endoplasmic reticulum stress-related proteins PERK, eIF2α, CHOP, IRE1α and ATF6α were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L AEA group.

7　內質網應激參與AEA誘導的OVCAR3細胞凋亡

在確定AEA對卵巢癌細胞自噬和內質網應激的影響作用后，我們嘗試進一步探究自噬和內質網應激在卵巢癌細胞凋亡過程中的具體作用。預先使用內質網應激激活劑衣霉素（tunicamycin，TMNI） 1.5 mg/L處理OVCAR3細胞1 h，能夠有效促進AEA對卵巢癌細胞的抑制作用，抑制OVCAR3細胞的活力（圖7A）。而預先使用內質網應激抑制劑?；切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid， TUDC）500 mg/L處理OVCAR3細胞1 h，卻能夠顯著降低AEA抑制OVCAR3細胞活力的能力（圖7B）。同時，我們在使用內質網應激激活劑和抑制劑后，利用流式細胞術檢測AEA對卵巢癌細胞凋亡的影響，結果表明，內質網應激激活劑TMNI可促進AEA誘導的卵巢癌細胞凋亡，而ERS抑制劑TUDC則減少了AEA誘導的卵巢癌細胞凋亡（圖7C）。從而提示內質網應激可促進AEA引起的卵巢癌細胞凋亡。

Figure 7.　Endoplasmic reticulum stress promoted apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells induced by AEA. A: the viability of ovarian cancer cells treated with tunicamycin, according to the CCK-8 assay; B: the viability of OVCAR3 ovarian cancer cells treated with tauroursodeoxycholic acid, according to the CCK-8 assay; C: the apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells treated with tunicamycin and tauroursodeoxycholic acid, according to the flow cytometry with PI/Annexin V-FITC staining. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs CON group; #P<0.05，##P<0.01 vs AEA group.

8　自噬影響AEA誘導的OVCAR3細胞凋亡

為了闡明自噬在AEA治療卵巢癌中的作用，預先使用3 mmol/L自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）處理OVCAR3細胞1 h，能夠有效促進AEA對卵巢癌細胞的抑制作用，抑制OVCAR3細胞的活力（圖8A）。同時利用Western blot檢測凋亡相關蛋白表達情況，結果顯示3-MA能顯著提高AEA誘導卵巢癌細胞凋亡的功能（圖8B）。

Figure 8.　Autophagy affected apoptosis of OVCAR3 ovarian cancer cells induced by AEA. A: the viability of OVCAR3 ovarian cancer cells treated with 3-MA, according to the CCK-8 assay; B: the protein levels of apoptosis related molecules in the OVCAR3 ovarian cancer cells treated with 3-MA determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs CON group; #P<0.05, ##P<0.01 vs AEA group.

9　內質網應激與自噬的相互調控關系

為了研究自噬與內質網應激的關系，我們預先使用內質網應激抑制劑TUDC處理OVCAR3細胞1 h，能夠有效抑制AEA引起的LC3B-Ⅱ水平上調（圖 9A），從而提示內質網應激促進AEA引起的細胞自噬。預先使用自噬抑制劑3-MA處理OVCAR3細胞 1 h，能夠進一步促進AEA引起的CHOP水平上調（圖9B），從而提示自噬能夠抑制AEA引起的內質網應激。

Figure 9.　The relationship between endoplasmic reticulum stress and autophagy in the OVCAR3 ovarian cancer cells. A: the expression of LC3B in OVCAR3 cells treated with TUDC, according to Western blot; B: the expression of CHOP in OVCAR3 treated with 3-MA, according to Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs CON group; #P<0.05, ##P<0.01 vs AEA group.

討論

本研究中，我們發現AEA在卵巢癌患者體內表達下調，而給予AEA處理可以有效降低卵巢癌細胞的活力及遷移和侵襲能力，且能明顯抑制卵巢癌瘤組織的生長。本研究進一步探討表明AEA通過抑制自噬、增強內質網應激，從而增加卵巢癌細胞的凋亡，進而治療卵巢癌。

卵巢癌是主要的婦科惡性腫瘤之一，2018年全球新發病例295 414例，死亡184 799例［2］。且大多數患者在放化療后，預后依然很差［14-15］，因此，迫切需要開發新的卵巢癌治療靶點。自90年代初發現大麻素系統以來，內源性大麻素已被證明對多種腫瘤具有明顯治療作用［16］。而AEA作為內源性大麻素的一種，也是大麻的活性成分，可通過結合大麻素受體發揮抑制細胞生長、增加細胞凋亡等作用［16］。本研究中，我們檢測了卵巢癌患者和健康對照組體內AEA表達水平，發現卵巢癌患者體內AEA的表達水平顯著下降，而ROC曲線評估表明AEA有成為卵巢癌患者早期靈敏性生物學標志物的可能，這與前人研究中表明內源性大麻素通過改變激素水平而影響機體生理功能，有望成為早期靈敏性生物學標志物的結果相似［6］。

最新研究顯示，內源性大麻素可以抑制多種腫瘤的細胞增殖［4， 17］。因此，在本實驗中，我們首先用CCK-8法檢測了AEA處理后OVCAR3卵巢癌細胞的活力，結果表明與對照組相比，經AEA處理的卵巢癌細胞的細胞存活率降低，且AEA處理的卵巢癌細胞的細胞存活率的降低與AEA藥物濃度呈正相關。為了進一步探討AEA的作用，本課題采用流式細胞技術檢測AEA處理的OVCAR3卵巢癌細胞的細胞凋亡率，結果顯示AEA可以增強或促進卵巢癌細胞的細胞凋亡。同時Western blot檢測凋亡相關蛋白結果也再一次佐證AEA可以增強或促進卵巢癌細胞的細胞凋亡。

上述實驗結果提示，AEA確實可以通過促進癌細胞凋亡，從而抑制卵巢癌細胞生長。為進一步明確AEA的治療作用，本實驗在動物水平上再一次驗證。當給予AEA治療后，小鼠皮下卵巢癌的增長速率顯著下降，提示AEA治療可以延緩卵巢癌的進展，有望成為治療卵巢癌的藥物。因此，本課題深入研究AEA發揮抑制卵巢癌作用的具體機制。

內質網是蛋白合成加工最大的工廠，是細胞內最重要的細胞器之一［18］。內質網應激表現為內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂，可激活未折疊蛋白反應、內質網超負荷反應和 caspase-12介導的凋亡通路等信號途徑，亦能獨立地誘導細胞凋亡，是細胞重要的防御機制之一［18］。大量研究表明，大麻素與內質網應激密切相關。Lee等［19］發現內源性大麻素激動劑可以誘導淋巴瘤細胞的內質網應激，這與本研究發現的AEA處理的卵巢癌細胞中內質網應激相關蛋白表達都顯著上調的結果一致。

研究表明，內質網應激對腫瘤細胞死亡的影響也是不盡相同的［20］，且內質網應激在AEA誘導的卵巢癌細胞凋亡中的作用也仍不明確。而本實驗中，我們發現隨著AEA劑量增加，內質網應激相關蛋白表達水平明顯增加，提示AEA可以誘導內質網應激且呈一定劑量依賴性。而當我們使用內質網應激激活劑后，卵巢癌細胞的細胞活力被顯著抑制，且流式細胞術檢測結果表明，內質網應激激活劑可以明顯增加卵巢癌細胞的細胞凋亡；同時，內質網應激抑制劑呈現相反的結果。上述結果提示，內質網應激促進AEA誘導的卵巢癌細胞凋亡作用，從而抑制卵巢癌的進展。

自噬是一種自我降解系統，在治療敏感和多藥耐藥癌癥時普遍出現。自噬對于多藥耐藥腫瘤來說可能是一把雙刃劍：它參與多藥耐藥的發展并保護腫瘤細胞免受化學治療，但也可以殺死凋亡途徑無活性的多藥耐藥癌細胞［10］。抗腫瘤藥物誘導的自噬也可以激活多藥耐藥細胞中的凋亡信號通路，促進多藥耐藥逆轉［10-11］。為了探討自噬在AEA誘導卵巢癌細胞凋亡中的作用，我們首先檢測不同濃度AEA處理下及AEA藥物治療后腫瘤組織內自噬相關蛋白表達情況，結果發現，隨著AEA濃度增加，自噬相關蛋白ATG5、BECN1和LC3蛋白表達顯著上調，而P62蛋白表達明顯減少，提示AEA處理可以促進卵巢癌細胞自噬。

自噬是不同于細胞凋亡的細胞死亡機制，其在細胞存活和死亡中具有重要作用，對人類的健康產生重要影響［21-22］。為闡明AEA處理的卵巢癌細胞中自噬的作用，我們使用自噬抑制劑預先處理卵巢癌細胞，而后檢測細胞的活力，結果表明抑制自噬可以有效增強AEA抑制卵巢癌細胞活力的作用。并進一步使用流式細胞技術檢測自噬抑制劑對AEA處理的卵巢癌細胞凋亡的影響，結果表明，自噬抑制劑可以增強AEA誘導的卵巢癌細胞凋亡。且用Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達水平，結果顯示，自噬抑制劑可以增加AEA處理的卵巢癌細胞的細胞凋亡相關蛋白的表達。上述結果提示，自噬在AEA誘導的細胞凋亡中起保護作用，而抑制自噬可以增強AEA的誘導凋亡效應。

細胞自噬與內質網應激間的緊密聯系已被學術界廣泛認可。報道證實［23］，利用內質網應激誘導劑可以激活自噬反應，而自噬可以平衡內質網應激誘導的內質網膨脹，促進細胞存活。與此相似，本課題中，內質網應激顯著增強卵巢癌細胞凋亡，而自噬卻抑制卵巢癌細胞凋亡發生，因此探索兩者間的關系顯得尤為重要。而我們發現預先給予內質網應激抑制劑處理卵巢癌細胞，能夠明顯降低細胞的自噬水平。同時，我們也觀察到預先給予自噬抑制劑 3-MA 處理卵巢癌細胞，能夠進一步促進內質網應激發生。以上研究結果可以認為自噬是一個“有益的監護人”，通過負反饋機制抑制內質網應激，調節AEA誘導的卵巢癌細胞凋亡。

總之，我們發現AEA可以抑制卵巢癌細胞的活力和遷移侵襲能力，誘導卵巢癌細胞凋亡，抑制卵巢癌組織增長，機制與內質網應激和自噬相關。這些結果提供了通過AEA增強人類卵巢癌細胞生長抑制作用從而達到誘導其凋亡的新治療策略，為探索卵巢癌的治療提供了新思路。

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Role of endoplasmic reticulum stress and autophagy mediated by endocannabinoid-arachidonic acid aminoethanol in ovarian cancer cells

HUANG Jing-ying， CHEN Xuan， RAO Jing-hong

（，，362000，）

To study the effect of endocannabinoid-arachidonic acid aminoethanol （AEA） on ovarian cancer and its mechanism.The serum levels of AEA in healthy control group and ovarian cancer group were analyzed by ELISA， and the diagnostic value of AEA in ovarian cancer patients was evaluated by ROC curve. The effects of AEA on the viability， migration and invasion abilities of the ovarian cancer cells were detected by CCK-8 assay， Transwell cell invasion test and Scratch test. The effect of AEA on ovarian cancer was further verified by the measurement of tumor volume， tumor weight and visual map of tumor tissue. Meanwhile， flow cytometry and Western blot were used to determine the effect of AEA on the apoptosis of ovarian cancer cells， so as to explore the mechanism of AEA promoting the apoptosis of ovarian cancer cells through detecting the endoplasmic reticulum stress and autophagy related proteins by Western blot.The serum levels of N-arachidonic aminoethanol in the patients with ovarian cancer were significantly decreased. ROC results suggested that AEA was a sensitive biological marker to distinguish the patients with ovarian cancer from healthy dedividuals. In addition， AEA inhibited the cell viability， migration and invasion abilities of ovarian cancer cells， and inhibited the growth of ovarian cancer tissues.By promoting endoplasmic reticulum stress and affecting autophagy of ovarian cancer cells， AEA promotes apoptosis of ovarian cancer cells.

Endogenous cannabinoids；-arachidonic acid aminoethanol； Ovarian cancer； Autophagy； Endoplasmic reticulum stress

R737.32； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.014

1000-4718（2020）11-2020-10

2019-10-25

2020-09-11

福建省泉州市科技計劃項目（No.2018Z073）

Tel: 15259762388； E-mail: Huangjy0235@yeah.net

（責任編輯：宋延君，余小慧）