連續性腎臟替代治療對急性腎損傷患者自噬相關蛋白表達及預后的影響

呂昕， 唐文學， 郭亮

連續性腎臟替代治療對急性腎損傷患者自噬相關蛋白表達及預后的影響

呂昕， 唐文學△， 郭亮

（杭州師范大學附屬醫院重癥醫學科，浙江 杭州 310000）

探討連續性腎臟替代治療（CRRT）對急性腎損傷（AKI）患者自噬相關蛋白表達及預后的影響。選取2015年2月~2018年3月于杭州師范大學附屬醫院被診斷為AKI并接受CRRT的患者共計174例。比較CRRT治療前后患者血漿白細胞介素1β （IL-1β）和白細胞介素6 （IL-6）蛋白水平及血單核細胞中微管相關蛋白1輕鏈3-II （LC3-II）、自噬相關蛋白5 （Atg5）和beclin-1的mRNA表達水平，并進一步分析上述分子的表達水平與患者血清肌酐（SCr）的相關性。根據治療4周后的生存情況，將入選患者分為死亡組（=43）和生存組（=131），對兩組患者上述指標的水平進行比較。CRRT后，患者外周血的IL-1β、IL-6和SCr水平均較治療前顯著下降（<0.05）， LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平顯著降低（<0.05）。死亡組患者LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平顯著高于生存組（<0.05）。IL-1β、IL-6、LC3-II和beclin-1的表達水平與SCr呈正相關（<0.05），然而Atg5的表達水平與SCr無顯著相關性（>0.05）。CRRT能夠降低AKI患者外周血自噬相關分子的mRNA表達水平，進而降低自噬水平，對AKI患者發揮保護性作用。自噬相關分子的mRNA可作為預測CRRT預后的重要指標。

急性腎損傷；連續性腎臟替代治療；自噬；炎癥因子；預后

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是重癥監護病房常見的疾病，連續性腎臟替代治療（continuous renal replacement therapy， CRRT）是目前臨床上治療AKI最常用且最為有效的治療手段之一［1］。細胞自噬能夠清除受損的細胞，但也能調控炎癥因子，參與炎癥反應，在AKI中發揮著重要的作用［2-3］。 CRRT能夠有效清除患者血液中的炎癥因子，但其對自噬活性的影響尚未被揭示，缺乏相關的實驗研究。本次研究旨在探討CRRT對AKI患者外周血自噬相關蛋白表達及預后的影響，進一步研究CRRT對AKI的保護機制。

材料和方法

1　一般資料

選取2015年2月~2018年3月在杭州師范大學附屬醫院被診斷為AKI并接受CRRT的患者共174例，引起AKI的原發病包括重癥急性胰腺炎（49例）、膿毒血癥（29例）、嚴重創傷及創傷術后（28例）、惡性腫瘤切除術后（20例）、骨科手術術后（9例）、心胸外科手術術后（24例）和腦出血術后（15例）。其中男性99例，女性75例，年齡26~75歲，平均（54.39±10.37）歲。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）符合國際改善全球腎臟病預后組織（Kidney Disease Improving Global Outcomes， KDIGO）公布的AKI診斷標準［4］；（3）無腎臟毒性藥物服用史。排除標準：（1）在本次診斷前已接受CRRT；（2）患者或其代理人不同意參與本實驗研究；（3）臨床資料不完整；（4）合并肝硬化、自身免疫性疾病、抑郁癥等疾病。所有患者均接受CRRT治療，具體采用連續靜脈-靜脈血液濾過（continuous veno-venous hemofiltration， CVVH）模式。預沖液為0.9％氯化鈉3 000 mL加入普通肝素100 mg，預沖時間30 min。血流速度控制在100～200 mL/min，治療劑量不低于35 mL·kg-1·h-1。治療4周內死亡（均因多臟器功能衰竭死亡）的患者共計43例，納入死亡組，其余131例患者納入生存組。死亡組中，男性27例，女性16例，平均年齡（55.04±9.48）歲，平均身高為（168.5±11.4） cm，平均體重為（63.4±6.4） kg，體重指數（body mass index， BMI）為（25.6±3.4） kg/m2， APACHE II評分為12.6±3.8， SOFA評分為6.8±2.1；生存組中，男性72例，女性59例，平均年齡（54.03±9.74）歲，平均身高為（169.4±9.7） cm，平均體重為（61.2±5.3） kg， BMI為（23.4±2.7） kg/m2， APACHE Ⅱ評分為12.1±1.8， SOFA評分為6.2±1.6。兩組患者的性別、年齡、身高、體重、BMI、APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較，差異無統計學顯著性。本次研究經杭州師范大學附屬醫院醫學倫理委員會審核通過。

2　方法

2.1外周血白細胞介素1β （interleukin-1β， IL-1β）和白細胞介素6 （interleukin-6，IL-6）水平的檢測在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血3 mL，置于抗凝管內，采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）檢測血漿中IL-1β和IL-6的水平，其中IL-1β由Abcam提供的人IL-1β ELISA試劑盒（貨號ab46052）進行檢測， IL-6由Thermo Fisher Scientific提供的人IL-6 ELISA試劑盒（貨號：EH2IL6）進行檢測。

2.2血清肌酐（serum creatinine， SCr）水平的檢測在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血3 mL， 3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，采用由貝克曼庫爾特公司提供的AU680全自動生化分析儀，檢測患者SCr的含量。

2.3自噬相關蛋白mRNA表達水平的檢測第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血5 mL，置入肝素抗凝管內，加入等量的Ficoll淋巴細胞分離液（北京同立海源生物科技有限公司），于室溫500×離心20 min，吸取最上層血漿，收集血漿層與淋巴細胞分離液交界面的單核細胞。加入1倍體積的含有5×103U/L肝素、2%滅活小牛血清的Hanks液， 200×離心10 min，吸取上清液，重復洗滌2次，用1%臺盼藍檢測細胞活力，細胞活力應>95%，進行細胞計數后，將單核細胞儲存于-80℃。在冷凍的單核細胞中加入Trizol溶液（Thermo Fisher Scientific），嚴格按照Trizol溶液的說明書提取單核細胞中的RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計檢測所提取RNA的質量。吸取1 μg合格的RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix （TaKaRa）將RNA逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix （Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System （Thermo Fisher Scientific）上進行RT-qPCR，檢測微管相關蛋白1輕鏈3-II （microtubule-associated protein 1 light chain 3-II， LC3-II）、自噬相關蛋白5 （autophagy-related protein 5， Atg5）和beclin-1的mRNA表達量。PCR條件為： 94℃ 1 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 40個循環。所有實驗孔重復4次，以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2.4觀察指標比較第1次CRRT前和多次CRRT后AKI患者血漿IL-1β和IL-6蛋白水平，以及血單核細胞中LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平，并進一步分析上述分子水平與SCr含量的關系。同時對CRRT治療28 d后的生存組和死亡組患者上述基因的表達水平進行比較

3　統計學處理

采用SPSS 22.0 for Mac軟件進行數據統計和分析。計量資料經正態分布檢驗后采用均數±標準差（mean±SD）的形式表示，組間采用獨立樣本檢驗進行比較，CRRT前后比較采用配對樣本檢驗；計數資料采用頻數（率）的形式表示，組間采用卡方檢驗進行比較；指標間的相關性采用Pearson’s相關性分析進行研究。以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平的比較

CRRT后，所有患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平均比治療前顯著下降（<0.05），見表2。

2　CRRT前后AKI患者單核細胞中自噬相關分子mRNA水平的比較

CRRT后AKI患者單核細胞中IL3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平均比治療前顯著降低（<0.01），見表2。

表2　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平及單核細胞中自噬相關分子mRNA水平的比較

**<0.01before CRRT.

3　CRRT后生存組和死亡組患者自噬相關分子mRNA水平的比較

死亡組患者治療后LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平均顯著高于生存組（<0.05），見表3。

表3　生存組和死亡組患者CRRT后自噬相關分子mRNA表達水平的比較

**<0.01survival group.

4　IL-1β、IL-6和自噬相關分子表達水平與SCr含量的相關性分析

AKI患者IL-1β （=0.79，=0.032）、IL-6 （=0.66，=0.003）、LC3-II （=0.54，=0.019）和beclin-1 （=0.63，=0.042）水平與SCr含量均呈正相關，而Atg5表達水平與SCr含量無顯著相關性（=0.64，=0.328）。

討論

AKI是指突發且持續的腎功能下降，臨床表現為氮質血癥、水電解質紊亂、少尿等。AKI的病因可分為腎前性、腎性和腎后性，其中腎前性AKI是臨床最為常見的類型，主要是由于全身循環血量減少導致的腎灌注不足，造成腎功能的損害。臨床上對于AKI的治療包括去除病因、穩定內環境、營養支持、處理并發癥及給予腎臟替代治療（renal replacement therapy， RRT）。CRRT是危重患者最常用的血液凈化技術，其主要原理是通過模仿腎小球的濾過，運用對流、彌散和對流的原理，清除溶質。與間斷血液透析相比， CRRT具有能夠穩定血液動力學、較高的溶質清除率、清楚炎性介質等優點［5-6］。既往的研究顯示，接受CRRT的危重患者的死亡率約為50%左右，而AKI患者接受CRRT的預后受到啟動時間、治療前血中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）水平、APACHE II評分、炎癥因子水平等的影響［7-9］。

自噬是細胞代謝和更新的必要過程，也是幫助細胞在嚴酷環境下存活的重要生理過程，同時自噬也是細胞凋亡的重要途徑。既往的研究發現，自噬體在維持腎臟功能、保護腎小管上皮細胞不受損傷等環節起到重要的作用［10-11］，但對于接受CRRT的AKI患者體內自噬相關分子表達及意義的研究極為欠缺。自噬是一種參與細胞質內細胞器和大分子物質降解的生理行為，且可通過雙層膜結構包裹待被降解的物質形成自噬體，且將其轉運至自噬溶酶體發生降解作用。LC3-II是一種非常重要的自噬相關蛋白，往往代表自噬體的出現。LC3-II的累積能夠激活巨噬細胞相關的免疫反應，釋放大量IL-1β、IL-6等炎癥因子，從而導致機體炎癥反應加劇，組織損傷加重［12-13］。我們的研究結果顯示，CRRT能夠有效減少患者體內IL-1β、IL-6等炎癥因子的聚集，同時亦能減少患者體內LC3-II的表達，提示CRRT能夠有效抑制AKI患者的炎癥反應和自噬，從而減少對腎臟的傷害。此外， beclin-1是另一種常見的具有自噬活性的分子，它作為PI3K復合體中的一部分，參與自噬體的形成，還能調節Atg蛋白的形成，從而促進細胞自噬［14-15］。相關文獻報道，大鼠發生AKI后，自噬相關蛋白beclin-1表達明顯上調，且隨著缺血時間的延長， beclin-1的表達水平逐漸升高［16］。我們的研究結果顯示， CRRT亦能夠有效降低beclin-1和Atg5的水平，提示CRRT能夠抑制自噬。通過比較不同預后的患者治療后自噬相關蛋白的表達水平，我們發現存活組患者體內LC3-II、beclin-1和Atg5表達水平都顯著低于死亡組，即CRRT后死亡患者體內的自噬情況無明顯改變，說明在AKI患者中，自噬相關蛋白表達水平與預后呈負相關，較低的自噬水平可以預測患者治療后較好的預后。LC3-II和beclin-1作為自噬體膜的標志蛋白，與細胞間的自噬和凋亡均有一定相關性，細胞的自噬和凋亡均可被應激反應所激活，兩者甚至可相互轉換。相關文獻報道，膿毒血癥大鼠的自噬體膜蛋白LC3-II和beclin-1表達水平明顯升高，并誘發細胞發生凋亡，且自噬蛋白的表達水平與體內的氧化應激反應成正比［17］。本研究中，死亡AKI患者LC3-II和beclin-1的表達水平明顯高于存活患者，分析其原因可能是患者中高表達的LC3-II和beclin-1可提高細胞凋亡水平，不利于腎臟修復，最終導致患者死亡。本課題組后續應進一步驗證此機制。

綜上所述，CRRT能夠降低AKI患者外周血自噬相關蛋白的mRNA表達水平，降低自噬水平，對AKI患者發揮保護性作用。自噬相關蛋白的mRNA表達水平可作為預測CRRT預后的重要指標，這為臨床治療AKI提供了新理論和新思路。

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Effect of continuous renal replacement therapy on mRNA expression of autophagy-related molecules and prognosis in patients with acute kidney injury

Lü Xin， TANG Wen-xue， GUO Liang

（，，310000，）

To explore the effect of continuous renal replacement therapy （CRRT） on mRNA expression of autophagy-related molecules and the prognosis in the patients with acute kidney injury （AKI）.A total of 174 patients from our hospital who were diagnosed to have AKI and underwent CRRT between February 2015 and March 2018 were involved in this study. The plasma levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6）， the serum creatinine （SCr） level， and the mRNA expression levels of autophagy-related molecules， including microtubule-associated protein 1 light chain 3-II （LC3-II）， autophagy-related protein 5 （Atg5） and beclin-1， in the monocytes from peripheral blood were compared before and after CRRT. According to the survival of AKI patients after 4 weeks of CRRT， the enrolled patients were divided into death group （=43） and survival group （=131）， and the mRNA expression levels of the above molecules were compared between the 2 groups.After CRRT treatment， the plasma levels of IL-1β and IL-6， the level of SCr， and the mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in the monocytes were significantly lower than those before CRRT treatment （<0.05）. The mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in death group were significantly higher than those in survival group （<0.05）. The positive correlation between SCr and IL-1β， IL-6， LC3-II or beclin-1 was observed （<0.05）， and no correlation between SCr and Atg5 was found （>0.05）.CRRT decreases the mRNA expression levels of autophagy-related molecules in the patients with AKI and reduces the autophagy activity， which is protective for the patients. These autophagy-related molecules may be applied as a potential markers to predict the prognosis of CRRT.

Acute kidney injury； Continuous renal replacement therapy； Autophagy； Inflammatory factors； Prognosis

R692； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.023

1000-4718（2020）11-2081-05

2020-07-06

2020-10-23

Tel: 18922750968； E-mail： xufengqing09@163.com

（責任編輯：余小慧，羅森）