微小RNA-22-3p負性調控人腹膜間皮細胞NLRP3的表達及功能*

伍軍， 李相友， 封寶紅， 李菊霜， 朱戈麗， 張艷霞， 畢智敏， 鞏雪敏

微小RNA-22-3p負性調控人腹膜間皮細胞NLRP3的表達及功能*

伍軍， 李相友△， 封寶紅， 李菊霜， 朱戈麗， 張艷霞， 畢智敏， 鞏雪敏

（武漢大學附屬同仁醫院，武漢市第三醫院腎內科，湖北 武漢 430074）

探討微小RNA-22-3p （miR-22-3p）對人腹膜間皮細胞核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）表達及功能的影響。將基因的3'-非翻譯區（3'-UTR）序列及其突變體克隆到雙螢光素酶報告基因載體psiCHECK2中，構建野生型及突變型重組雙螢光素酶報告質粒，與miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor共轉染LPS預處理的人腹膜間皮細胞株HMrSV5，檢測螢光素酶活性；HMrSV5細胞隨機分為以下6組： miR-22-3p NC+LPS組、miR-22-3p NC+LPS+ATP組、miR-22-3p mimic+LPS組、miR-22-3p mimic+LPS+ATP組、miR-22-3p inhibitor+LPS組和miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP組。RT-qPCR和Western blot檢測NLRP3 mRNA和蛋白的表達，ELISA檢測白細胞介素1β （IL-1β）的表達和caspase-1的活性，Western blot檢測caspase-1 p20蛋白的表達。NLRP3-3'-UTR野生型與miR-22-3p mimic共轉染HMrSV5細胞后，螢光素酶活性較對照組降低（<0.05）；NLRP3-3'-UTR野生型與miR-22-3p inhibitor共轉染HMrSV5細胞后，螢光素酶活性較對照組升高（<0.05）。與miR-22-3p NC+LPS組比較，miR-22-3p mimic+LPS組NLRP3的mRNA和蛋白表達、IL-1β和caspase-1 p20的水平均下降且caspase-1活性減弱（<0.05），而miR-22-3p inhibitor+LPS組NLRP3的mRNA和蛋白表達、IL-1β和caspase-1 p20的水平均上升且caspase-1的活性增強（<0.05）。與miR-22-3p NC+LPS+ATP組比較， miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP組NLRP3的mRNA和蛋白表達、IL-1β和caspase-1 p20的水平均上升且caspase-1的活性增強（<0.05）。miR-22-3p可負性調控人腹膜間皮細胞NLRP3的表達及功能。

微小RNA-22-3p；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；人腹膜間皮細胞；腹膜透析；終末期腎臟病

腹膜透析是終末期腎臟病（end-stage renal disease， ESRD）患者的重要腎臟替代治療方法，具備保護殘余腎功能、早期生存率優勢等優點［1-3］。腹膜間皮細胞是構成腹膜的主要細胞群體之一，其位于腹膜巨噬細胞和間皮下微血管之間緊密連接的關鍵部位。然而，在長期高糖腹膜透析液作用下，腹膜間皮細胞可產生活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）、分泌炎癥因子，使細胞長期處于慢性炎癥狀態，從而啟動新生血管形成及腹膜組織纖維化過程［4-5］，最終導致腹膜功能障礙，患者不得不退出腹膜透析。因此，及時減輕或緩解間皮細胞炎癥反應有助于延緩新生血管形成以及腹膜纖維化的到來。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體在機體炎癥和免疫中發揮關鍵作用，其可被多種類型的病原微生物或危險信號所識別并激活，促進胱天蛋白酶1 （caspase-1）活化，活化的caspase-1切割位于炎癥反應上游的白細胞介素1β （interleukin-1β， IL-1β）和IL-18前體，產生相應的成熟細胞因子，從而啟動炎癥反應［6］。我們既往的研究證實，高糖腹膜透析液作用于腹膜間皮細胞可提升細胞線粒體的ROS水平，而升高的ROS激活NLRP3-IL-1β，啟動線粒體自噬清除受損線粒體，降低細胞ROS水平；應用ROS抑制劑則可削弱NLRP3-IL-1β活化，從而減輕腹腔慢性炎癥反應，提示負性調控NLRP3可作為干預腹膜透析腹腔慢性炎癥的靶點之一［7-8］。前期我們還應用生物信息學數據庫預測了微小RNA-22-3p （microRNA-22-3p， miR-22-3p）與NLRP3可能的靶向結合位點，并構建NLRP3-3'-UTR野生型（wild-type， WT）及突變型（mutant， mut）雙螢光素酶報告基因載體， NLRP3-3'-UTR野生型與miR-22-3p mimic共轉染293T細胞后，螢光素酶活性降低，于是初步認為miR-22-3p可負性調控基因及功能［9］。本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）致敏腹膜間皮細胞，探討miR-22-3p對三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）誘導的NLRP3炎癥小體活化的影響及機制。

材料和方法

1　材料

人腹膜間皮細胞株HMrSV5購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection， ATCC）。

逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司； qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司； DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）購自天根生化科技（北京）有限公司；雙螢光素酶報告基因載體psiCHECK2（包含海腎螢光素酶基因和螢火蟲螢光素酶基因）、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega； miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor及陰性對照購自吉瑪基因；抗NLRP3抗體購自ABGENT；抗caspase-1 p20抗體購自Adipogen； IL-1β ELISA試劑盒購自聯科生物科技有限公司； caspase-1活性檢測試劑盒購自BioVision。

2　實驗方法

2.1細胞轉染體外培養取人腹膜間皮細胞株HMrSV5第5~10代用于實驗研究，參考我們前期的報道［7］，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養，取處于對數生長期，生長狀態良好的細胞，以每孔5×105的細胞密度分別接種于6孔板， 37℃培養過夜；當細胞匯合70%左右時開始轉染，轉染前2 h換成無血清DMEM培養基，參照LipofectamineTM2000說明書進行轉染。將細胞分為miR-22-3p NC+psiCHECK2組、miR-22-3p NC+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組、miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組、miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組、miR-22-3p inhibitor+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組和miR-22-3p inhibitor+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組。每組設3個平行孔，重復3次。

2.2雙螢光素酶活性的檢測轉染后48 h吸盡細胞培養液加入細胞裂解液充分裂解細胞，（10 000~15 000）×離心3~5 min，取上清用于測定。按雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒提供實驗方案，計算相對螢光素酶活性。

2.3RT-qPCR和Western blot檢測HMrSV5細胞NLRP3的mRNA和蛋白表達HMrSV5細胞分別轉染miR-22-3p NC、miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor，轉染后48 h吸盡細胞培養液加入細胞裂解液充分裂解細胞用于實驗。將細胞分為miR-22-3p NC+LPS組、miR-22-3p NC+LPS+ATP組、miR-22-3p mimic+LPS組、miR-22-3p mimic+LPS+ATP組、miR-22-3p inhibitor+LPS組和miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP組，各組中LPS的濃度為1 mg/L，與細胞作用時間為4 h，而ATP濃度為5 mmol/L，于LPS加入前作用細胞30 min。收集細胞，應用RT-qPCR和Western blot檢測NLRP3的mRNA和蛋白表達。RT-qPCR所用引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2.4HMrSV5細胞IL-1β含量和caspase-1活性的檢測實驗分組同2.3，收集細胞上清，分別按IL-1β ELISA試劑盒說明書和caspase-1活性檢測試劑盒說明書進行檢測。

2.5Western blot檢測HMrSV5細胞caspase-1 p20蛋白的表達實驗分組同2.3，收集細胞上清，用Western blot檢測細胞上清caspase-1 p20蛋白的表達，具體實驗方法與本課題組之前的報道相同［5］。

3　統計學處理

全部數據采用SPSS 21.0統計軟件分析。計量資料用均數±標準差（mean±SD）表示，根據方差齊性檢驗結果，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用SNK-檢驗，以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　雙螢光素酶活性檢測

與miR-22-3p NC+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組相比， miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組螢光素酶活性顯著降低（<0.05），miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組螢光素酶活性無顯著變化， miR-22-3p inhibitor+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組螢光素酶活性顯著升高（<0.05）， miR-22-3p inhibitor +psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組螢光素酶活性無顯著性改變（>0.05），見圖1。上述結果提示， miR-22-3p可靶向調控HMrSV5細胞基因。

Figure 1.　The dual luciferase activity in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT group.

2　HMrSV5細胞miR-22-3p表達的變化

HMrSV5細胞分別轉染miR-22-3p NC、miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor后，RT-qPCR檢測結果顯示miR-22-3p mimic轉染組miR-22-3p的表達較對照組明顯升高（<0.05），miR-22-3p inhibitor轉染組miR-22-3p的表達較對照組明顯降低（<0.05），見圖2。

Figure 2.　The expression of miR-22-3p in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR+22-3p NC group.

3　miR-22-3p對HMrSV5細胞NLRP3 mRNA和蛋白表達的影響

經LPS預處理的HMrSV5細胞分別轉染miR-22-3p NC、miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor后，檢測NLRP3 mRNA和蛋白表達，結果顯示，與miR-22-3p NC+LPS組比較， miR-22-3p mimic+LPS組NLRP3 mRNA和蛋白表達下降（<0.05），轉染miR-22-3p inhibitor組NLRP3 mRNA和蛋白表達升高（<0.05）； NLRP3激動劑ATP可有效上調NLRP3 mRNA及蛋白表達，然而，相較于miR-22-3p NC+LPS+ATP組， miR-22-3p mimic+LPS+ATP組NLRP3 mRNA及蛋白水平仍顯著降低（<0.05），表明miR-22-3p可負性調控NLRP3的表達，見圖3。

Figure 3.　The effect of miR-22-3p transfection on expression of NLRP3 at mRNA (A) and protein (B) levels in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS group; #P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS+ATP group.

4　轉染miR-22-3p對HMrSV5細胞IL-1β表達的影響

HMrSV5細胞分組處理后ELISA檢測細胞上清IL-1β的含量。結果可見，與miR-22-3p NC+LPS組比較， miR-22-3p mimic+LPS組的IL-1β含量顯著降低（<0.05）， miR-22-3p inhibitor+LPS組的IL-1β含量顯著升高（<0.05）；此外， miR-22-3p mimic+LPS+ATP組IL-1β的含量較miR-22-3p NC+LPS+ATP組顯著減少（<0.05），見圖4。

Figure 4.　The effect of miR-22-3p transfection on expression of IL-1β in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS group; #P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS+ATP group.

5　轉染miR-22-3p 對細胞caspase-1活性的影響

HMrSV5細胞分組處理后，檢測細胞caspase-1活性。結果可見，與miR-22-3p NC+LPS組比較，miR-22-3p mimic+LPS組的caspase-1活性下降（<0.05），miR-22-3p inhibitor+LPS組的caspase-1活性升高（<0.05），此外，miR-22-3p mimic+LPS+ATP組caspas-1的活性較miR-22-3p NC+LPS+ATP組明顯降低（<0.05），見圖5。

Figure 5.　The effect of miR-22-3p transfection on the activity of caspase-1 in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS group; #P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS+ATP group.

6　轉染miR-22-3p 對HMrSV5細胞caspase-1 p20蛋白表達的影響

HMrSV5細胞分組處理后，檢測細胞caspase-1 p20的表達水平。結果可見，與miR-22-3p NC+LPS組比較，miR-22-3p mimic組的caspase-1 p20表達下降（<0.05），miR-22-3p inhibitor+LPS組的caspase-1 p20表達升高（<0.05）；此外，miR-22-3p mimic+LPS+ATP組caspas-1 p20的表達較miR-22-3p NC+LPS+ATP組明顯減少（<0.05），見圖6。

討論

臨床上長期應用高糖腹膜透析液所致的腹腔慢性炎癥、腹膜纖維化是腹膜透析技術的瓶頸，是學者們一致重點關注的研究領域。NLRP3炎癥小體是核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization domain， NOD）樣受體（NOD-like receptor， NLR）家族成員之一，其可廣泛識別細胞內外的應激和危險信號， NLRP3持續激活可導致廣泛的組織損傷并參與許多急慢性炎癥性疾病的發生［10］。前期體內外的實驗研究證實：高糖腹膜透析液可通過ROS誘導NLRP3-IL-1β活化，啟動線粒體自噬或者應用ROS抑制劑均可削弱NLRP3-IL-1β的活化，從而減輕腹腔慢性炎癥，提示負性調控NLRP3可作為干預腹膜透析腹腔慢性炎癥的靶點之一［7-8］。

研究證實，miR-22通過有效結合靶基因、阻斷靶基因的表達在抑制腫瘤生長、轉移、抗腫瘤治療方面發揮重要作用［11-13］。那么， miR-22是否可以阻斷基因的表達及功能，發揮對抗炎癥的作用呢？

前期我們成功構建NLRP3-3'-UTR野生型及突變型雙螢光素酶報告基因載體，在293T細胞中初步證實miR-22-3p可負性調控基因及功能［9］，在此基礎上本實驗在腹膜間皮細胞中發現，miR-22-3p模擬物可抑制NLRP3-3'-UTR野生型螢光素酶活性、miR-22-3p抑制物可提升NLRP3-3'-UTR野生型螢光素酶活性；進一步的實驗發現，LPS預刺激的腹膜間皮細胞轉染miR-22-3p模擬物可下調NLRP3的mRNA和蛋白表達、miR-22-3p抑制物可上調NLRP3的mRNA和蛋白表達，上述實驗提示miR-22-3p可負性調控腹膜間皮細胞基因的表達。那么，miR-22-3p是如何調控NLRP3功能的？為此我們進一步驗證了NLRP3下游IL-1β和caspase-1 p20蛋白的表達以及caspase-1的活性，腹膜間皮細胞轉染miR-22-3p模擬物可下調IL-1β和caspase-1 p20蛋白表達并減弱caspase-1活性、miR-22-3p抑制物可上調IL-1β、caspase1 p20蛋白的表達并提升caspase-1活性，加用NLRP3的激動劑ATP處理細胞并不影響miR-22-3p模擬物的作用，NLRP3的表達仍較miR-22-3p NC+LPS+ATP組降低。由此我們認為，miR-22-3p可負性調控人腹膜間皮細胞NLRP3的表達及功能。新近的研究發現，在胃癌組織中NLRP3表達異常升高，不僅啟動胃粘膜上皮細胞的炎癥反應還促使上皮細胞異常增生和胃癌的發生；miR-22可直接結合NLRP3-3'-UTR，抑制后者的高表達及生物學效應［14］。在口腔鱗狀上皮細胞癌組織及細胞系中觀察到miR-22表達明顯低下，NLRP3的表達卻明顯升高；過表達miR-22可逆轉NLRP3激活所致的促腫瘤效應［15］。除腫瘤領域外，研究者還發現，miR-22通過靶向抑制基因，減少冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞凋亡及下調促炎癥因子的表達，對大鼠心肌微血管內皮細胞發揮保護作用［16］。本研究與上述研究的結果類似，但本研究未能在動物模型中加之證實，這也是本研究的不足之處。下一步我們擬建立腹膜透析模型鼠，觀察miR-22-3p腹腔內注射后對高糖腹膜透析液作用下NLRP3表達及功能的影響。

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MicroRNA-22-3p negatively regulates NLRP3 expression and function in human peritoneal mesothelial cells

WU Jun， LI Xiang-you， FENG Bao-hong， LI Ju-shuang， ZHU Ge-li， ZHANG Yan-xia， BI Zhi-min， GONG Xue-min

（，，，430074，）

To investigate the role of microRNA-22-3p （miR-22-3p）in regulating nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3）expression and function in human peritoneal mesothelial cells.The 3'-UTR sequence ofgene and its mutants were cloned into the dual luciferase reporter plasmid psiCHECK2 respectively to construct a wild-type and mutant recombinant dual luciferase reporter plasmid. An SV40-immortalized human peritoneal mesothelial cell line HMrSV5 pretreated with lipopolysaccharide （LPS） was generated and transfected with recombinant dual luciferase reporter plasmid and miR-22-3p mimic or miR-22-3p inhibitor respectively， then the luciferase activity was detected. In addition， the HMrSV5 cells were randomly divided into 6 groups： miR-22-3p NC+LPS， miR-22-3p NC+LPS+ATP， miR-22-3p mimic+LPS， miR-22-3p mimic+LPS+ATP， miR-22-3p inhibitor+LPS and miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP. RT-qPCR and Western blot were used to evaluate the expression of NLRP3. ELISA was used to measure the content of interleukin-1β （IL-1β） and the activity of caspase-1. The expression of caspase-1 p20 was determined by Western blot.Wild-type NLRP3 recombinant plasmid and miR-22-3p mimic co-transfection significantly decreased the luciferase activity compared with control group （<0.05）， while wild-type NLRP3 recombinant plasmid and miR-22-3p inhibitor co-transfection significantly increased the luciferase activity compared with control group （<0.05）. Compare with miR-22-3p NC+LPS group， the expression of NLRP3 at mRNA and protein levels， the content of IL-1β， the expression of caspase-1 p20 and the activity of caspase-1 were decreased in miR-22-3p mimic+LPS group （<0.05）， while the expression of NLRP3 at mRNA and protein levels， the content of IL-1β， the expression of caspase-1 p20 and the activity of caspase-1 were increased in miR-22-3p inhibitor+LPS group （<0.05）. Compare with miR-22-3p NC+LPS group， the expression of NLRP3 at mRNA and protein levels， the content of IL-1β， the expression of cspase-1 p20 and the activity of caspase-1 were increased in miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP group （<0.05）.miR-22-3p negatively regulates NLRP3 expression and function in human peritoneal mesothelial cells.

MicroRNA-22-3p； Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3； Human peritoneal mesothelial cells； Peritoneal dialysis； End-stage renal disease

R692.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.021

1000-4718（2020）11-2068-06

2019-11-19

2020-04-09

湖北省自然科學基金資助項目（No.2016CFB590）；湖北省衛健委科研項目（No.WJ2019Q001）；武漢市科技局應用基礎前沿項目（No.2019020701011434）；武漢市衛計委科研項目(No.WX16B09)

Tel： 027-68894905； E-mail： lixiangyou3@163.com

（責任編輯：林白霜，余小慧）