HPLC法測定頭孢拉定膠囊強制降解產物的研究

張繼紅，鄭露盼，黃道明

上饒市食品藥品檢驗檢測中心，江西 上饒 334000

頭孢拉定為第一代半合成頭孢菌素，耐酸，可以口服，吸收好，血藥濃度較高，特別是耐β 內酰胺酶，對耐藥性金葡菌及其它多種對廣譜抗生素耐藥的桿菌等有迅速而可靠的殺菌作用［1］，臨床主要用于呼吸道、泌尿道、皮膚和軟組織等的感染。當前藥物安全性問題已成為全球越來越關注的焦點，而有關物質研究及控制是保證藥品安全的關鍵要素之一，各國藥品質量標準對有關物質檢查的要求也越來越高［2-10］。在藥品質量與降解程度檢測中，有關物質是一項重要的反映指標，為有效控制產品質量，對生產、運輸及儲藏過程中可能產生的有關物質進行控制，本文采用高效液相色譜法（HPLC）［11-13］對頭孢拉定膠囊的強制降解產物進行測定研究，能為頭孢拉定制劑穩定性研究提供重要依據，為藥品的生產，運輸及貯存條件提供重要參考［14,15］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（日本島津公司）；電子天平（sartorius公司）；恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)；pH計（Thermo公司）。

1.2 試劑試藥

頭孢拉定膠囊（A企業，批號：1812102，250 mg/粒）；頭孢拉定對照品（批號：130427-201107，含量88.3%），頭孢氨芐對照品（批號：130408-201411，含量94.4%），7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸對照品（批號：130416-201006，含量98.5%），雙氫苯甘氨酸對照品（批號：130434-201403，含量94.7%），以上均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純（美國avantor公司），其他均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以1%磷酸二氫銨溶液（用磷酸調節pH值到4.5）∶乙腈（93∶7）為流動相，檢測波長為254 nm,流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液精密稱取頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液精密稱取雙氫苯甘氨酸10.87 mg、頭孢拉定12.15 mg、頭孢氨芐10.29 mg、7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸11.53 mg,置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為混合對照溶液。

2.2.3 自身對照溶液精密量取供試品溶液1 mL，置于200 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為自身對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2.2”項下溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，出峰順序為7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸、雙氫苯甘氨酸、頭孢氨芐和頭孢拉定，各峰的理論塔板數分別是5 476、15 923、17 942和18 723，分離度分別為2.6、38.4和12.0，均符合要求。

2.4 破壞性試驗

考察本品在酸、堿、氧化、高溫、光照和紫外線條件下的降解情況。由降解試驗結果得知本品在高溫、光照和紫外線條件下基本上沒有明顯的降解雜質，而在酸、堿和氧化條件下有明顯的降解雜質，根據各降解條件下出現的雜質峰檢出情況及相對保留時間來確定雜質峰的歸屬。

2.4.1 酸破壞精密稱取頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加1 mol/L的鹽酸溶液1 mL、50 ℃水浴3 h，用氫氧化鈉溶液調pH值近中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為酸破壞樣品。

2.4.2 堿破壞精密稱取頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液1 mL、50 ℃水浴3 h，用鹽酸溶液調pH值近中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為堿破壞樣品。

2.4.3 氧化破壞精密稱取頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加0.5%的過氧化氫溶液1 mL、放置1 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為氧化破壞樣品。

2.4.4 高溫破壞精密稱取在80、100、120 ℃的烘箱中放置1、3和5 h的頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為高溫破壞樣品。

2.4.5 光照破壞精密稱取在4 500 lx光照條件下照射1、3、5和7 d的頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為光照破壞樣品。

2.4.6 紫外線破壞精密稱取在254 nm紫外線條件下照射1 h、5 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d的頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為紫外線破壞樣品。強制降解試驗結果顯示，頭孢拉定膠囊粉末在高溫、光照及紫外線條件下相對穩定，無明顯的降解產物產生，主峰面積無明顯變化，而在酸、堿及氧化條件下均有明顯的降解產物生成,主峰之后基本無明顯的降解產物生成。在酸破壞試驗中，主峰降解12%左右，出現明顯的8個雜質峰；在堿破壞試驗中，主峰降解19%左右，出現明顯的8個雜質峰；在氧化破壞試驗中，主峰降解18%左右，出現明顯的9個雜質峰，主要降解產物圖譜見圖1。

2.5 穩定性試驗

取“2.2.1”項下溶液，室溫放置0、1、3、5、7、9、12、24 h，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄各成分峰面積，計算頭孢拉定和頭孢氨芐峰面積的RSD，結果分別為0.3%和0.3%，表明供試品在24 h內穩定，可滿足本品測定的要求。

2.6 檢出限與定量限

精密稱取頭孢拉定對照品適量，用流動相溶解并逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件測定，以信噪比S/N=3和S/N=10計，測得頭孢拉定檢出限和定量限分別約為0.01 ng/mL和0.03 ng/mL。

2.7 線性關系

精密稱取頭孢拉定對照品適量，用流動相溶解制成含頭孢拉定1 mg/mL的溶液，分別逐級稀釋，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對頭孢拉定濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y=1×107X+56 756（相關系數為r=0.999 9），表明頭孢拉定濃度與色譜峰面積在1 μg/mL～100 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.8 精密度試驗

取“2.2.1”項下溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，連續進樣6次，計算頭孢拉定和頭孢氨芐峰面積的RSD，結果分別為0.4%和0.3%，表明儀器的精密度良好。

2.9 重復性試驗

取同一批次樣品，按“2.2.1”項下制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件測定，頭孢氨芐、其他單個最大雜質和總雜質測量均值為1.8%、0.7%和0.9%，RSD分別為0.8%、1.0%和0.9%，表明該方法重復性良好。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過對雙氫苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸、頭孢氨芐、孢拉定及降解雜質進行DAD全波長掃描檢測，除了雙氫苯甘氨酸在220 nm處有最大吸收，其它均在254 nm附近有較大吸收，故以254 nm作為降解產物的檢測波長。

3.2 耐用性

選擇3個不同品牌的C18色譜柱，分別在不同的高效液色譜儀上進行耐用性考察，結果峰形和分離度效果差別不大，本法耐用性良好。

3.3 強制降解條件的選擇

在酸強制降解試驗中，通過添加不同濃度（0.1、0.5、1.0和2.0 mol/L）、不同體積（1和2 mL）、放置不同時間（0.5、1、2、3和5 h）和不同溫度（室溫和50 ℃）的鹽酸溶液作為降解條件，以主峰降解比例及能檢出的雜質峰為依據，最終選擇加1 mol/L的鹽酸溶液1 mL、50 ℃水浴3 h為酸降解試驗條件；在堿強制降解試驗中，通過添加不同濃度（0.1、0.05和0.01 mol/L）、不同時間（0.5、1、2、3和5 h）、不同體積（1和2 mL）和不同溫度（室溫、50和70 ℃）的氫氧化鈉溶液作為降解條件，和不同濃度（0.1、0.3和0.5 mol/L）、不同時間（0.5、1、2、3和5 h）、不同體積（1和2 mL）和不同溫度（室溫、50 ℃、70℃）的碳酸氫鈉溶液作為降解條件，以主峰降解比例及能檢出的雜質峰為依據，最終選擇加0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液1 mL、50 ℃水浴3 h為堿降解試驗條件；在氧化強制降解試驗中，通過添加不同濃度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0% 及10.0%）的過氧化氫溶液1 mL和不同的放置時間（1、3、5 h）的降解條件，以主峰降解比例及能檢出的雜質峰為依據，最終選擇加0.5%的過氧化氫溶液1 mL、放置1 h為氧化降解試驗條件；在高溫（置80、100和120 ℃的烘箱中放置1、3和5 h）、光照（4 500 lx照射1、3、5、7和10 d）和紫外線（254 nm紫外線下照射1 h、5 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d）強制降解條件下，樣品主峰面積基本沒變化，也無明顯的雜質峰。

3.4 流動相的選擇

《中國藥典》中采用水-甲醇-3.86%醋酸鈉溶液-4%醋酸溶液（1 564∶400∶30∶6）為流動相，此流動相比較復雜，本文考察了1%磷酸二氫銨∶乙腈、1%磷酸二氫銨 :甲醇、0.23%磷酸二氫銨∶乙腈、0.23 %磷酸二氫銨 :甲醇、0.72%醋酸鈉∶乙腈、0.72%醋酸鈉∶甲醇、0.27%磷酸二氫鉀∶乙腈、0.27%磷酸二氫鉀∶甲醇八種流動相，同時水系流動相分別調不同的pH值進行試驗，結果顯示，當1%磷酸二氫銨溶液（用磷酸調節pH值到4.5）∶乙腈為（93∶7）時，主峰出峰時間適當，峰型對稱，且各雜質峰能達到有效分離，是較理想的流動相。

4 總結

通過自制頭孢拉定膠囊強制降解產物，建立新的HPLC法來測定降解雜質，該方法對頭孢拉定降解雜質能達到有效分離、專屬性強、靈敏度高、耐用性好，適用于頭孢拉定原料及制劑的雜質分析，可供相關質量標準修訂提供參考。但對強制降解雜質是如何降解和結構推測還有待進一步分析研究。