海洋假交替單胞菌產胞外活性氧特性研究

郭 定 環， 王 競， 顧 晨， 郭 雅 麗

( 大連理工大學 環境學院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

目前僅僅發現了無光環境中細菌產生胞外ROS的現象，但黑暗條件下細菌形成胞外ROS的影響因素、反應條件和動力學特性等研究則未見報道.基于此，本文開展無光條件下海洋Pseudoalteromonassp. GCY產胞外ROS特性研究.

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

1.2 實驗方法

表1 OPs的濃度范圍

1.2.3 酶活性測定 測定菌株生長期內，胞外過氧化氫酶(catalase，CAT)活性和LAAO活性.向胞外液中加入等量、足量的H2O2，使終濃度約為100 μmol/L，定義25 ℃、避光條件下，1 h去除100 μmol/L H2O2的CAT活性為100%；向胞外液中添加足量L-亮氨酸，使終濃度為5 mmol/L，定義1 h內增加5 μmol/L的H2O2時LAAO酶活性A為100%[20].

1.3 分析方法

生物量用D(600 nm)表示，用紫外-可見分光光度計(光譜儀器SP-756P)測定；H2O2測定采用N，N-二乙基對苯二胺/辣根過氧化物酶法[21]；數據處理和圖像繪制采用Origin軟件.

2 結果與討論

2.1 基質對ROS胞外形成特性的影響

不同基質、不同濃度條件下，菌株GCY生長情況和產胞外H2O2存在差異(圖1)，6 g/L濃度的基質能基本滿足菌株生長需要，對數期沒有檢出H2O2，穩定期H2O2濃度逐漸升高.綜合考慮菌株胞外H2O2濃度和生物量情況，選取6 g/L的蛋白胨和牛肉膏進行后續研究.在6 g/L的蛋白胨和牛肉膏體系中，雖然菌體生物量基本一致，H2O2的濃度變化趨勢也相同，但是，兩體系中H2O2的濃度存在較大差別，其中，蛋白胨體系中H2O2的最大濃度為(1.5±0.1) μmol/L，而牛肉膏中達到(8.1±0.6) μmol/L.綜上所述，菌株在蛋白胨和牛肉膏體系中均能產生H2O2，而在牛肉膏體系中濃度更高；另外，H2O2的產生與菌株的生長期有關.

(a) 蛋白胨

(b) 牛肉膏

圖2 不同濃度蛋白胨和牛肉膏對產胞外的影響

圖3 6 g/L蛋白胨和牛肉膏對產胞外的影響

2.2 OPs對胞外ROS形成特性影響

2.2.1 OPs對產胞外H2O2的影響 實驗選取6 g/L蛋白胨體系考察了IBP、SMX、NAP、DMP等海洋環境中常見的OPs對菌株GCY產胞外H2O2的影響.實驗結果如圖4所示.首先，各OPs體系中，H2O2的產生均與菌株的生長周期相關，對數期沒有檢測到H2O2，穩定期末期濃度有明顯上升；另外，在添加了IBP體系中，添加濃度越高，同一時刻的H2O2的濃度越高；而SMX、NAP、DMP體系則對胞外H2O2濃度無明顯影響.除此之外，實驗還發現苯酚和雙酚A促進菌株GCY產胞外H2O2.

2.3 胞外ROS形成機理分析

2.3.1 胞外H2O2形成機理分析 Seaver等[22]研究發現Escherichiacoli細胞可通過胞內抗氧化系統控制胞內H2O2在很低水平，約0.2 μmol/L，且由于H2O2向胞外擴散的速率有限，對胞外H2O2濃度貢獻有限.實驗觀察到圖1中多處胞外H2O2濃度遠大于0.2 μmol/L，故推測胞外H2O2主要是胞外生成.另外，以前普遍認為，H2O2在生物膜上的轉運為自由擴散，但是最近研究表明H2O2的轉運不是簡單的自由擴散，有的生物膜對H2O2的透過性較差，而通道蛋白可能促進H2O2的擴散[23].當外加適量濃度的H2O2，對于不同生物膜，胞內胞外H2O2處于穩態平衡時，胞外H2O2濃度普遍是胞內H2O2濃度的7～10倍，有的高達650倍[24]，因此圖1中胞外H2O2濃度達到近10 μmol/L是合理的.

(a) IBP

(b) SMX

(c) NAP

(d) DMP

(a) IBP

(b) SMX

(c) NAP

(d) DMP

本課題組前期研究發現，菌株GCY產胞外H2O2與LAAO有關，且該LAAO對L-亮氨酸反應活性最強[6].以6 g/L蛋白胨和牛肉膏體系為例，通過測定體系中CAT活性和LAAO活性(圖6)，發現不同時期的CAT活性存在差異，對數期最強，后逐漸減弱；LAAO活性在對數期為零，穩定期逐漸增強，衰亡期減弱.LAAO和CAT在合適條件下可分別產生和消耗H2O2，因此兩者反應的相對強弱可導致胞外H2O2濃度的動態變化，CAT活性逐漸降低，而LAAO活性升高，這可能是體系中H2O2濃度升高的原因.

圖6 6 g/L牛肉膏體系中CAT和LAAO活性

與菌株GCY同屬的Pseudoalteromonastunicata產生的抗菌自溶蛋白AlhP及海洋細菌Marinomonasmediterranea分泌的胞外酶L-賴氨酸-ε-氧化酶(LodA)是同源物，二者均能在生物膜發育過程中通過產生H2O2介導細胞死亡[25]，本課題組前期研究發現，LodA等LAAO的編碼序列存在于菌株GCY的基因組中[17].鑒于此，推測菌株GCY也可分泌LodA等LAAO，通過產生H2O2介導細胞死亡；Gmez等研究發現Marinomonasmediterranea在穩定期分泌LodA至胞外[26]，這與實驗結論2.1.1中對數期沒有檢出H2O2，穩定期H2O2濃度逐漸升高及對數期LAAO活性為零(圖6)一致，因此推測胞外H2O2的產生為生長非偶聯型.

為驗證200 mg/L的IBP促進產胞外H2O2與胞外CAT和LAAO活性有關，實驗考察了體系84 h時對這兩種酶活性A的影響，結果如圖7所示，表明添加不同濃度的IBP對于CAT的活性影響不大，但是添加200 mg/L的IBP大大增強了LAAO活性.

圖7 IBP對CAT和LAAO活性的影響

3 結 語