miR-96調節結核分枝桿菌誘導的活動性肺結核的機制*

武麗， 張艷麗， 田艷紅， 羅培培， 劉亞林， 周儼

(1.保定市人民醫院 結核科， 河北 保定 071000； 2.重慶市江津區中心醫院 婦科， 重慶 江津 402260)

結核分枝桿菌是一種兼性巨噬細胞寄生菌[1-3]，必須寄生在其它細胞內。結核病是由結核分枝桿菌(M.Tuberculosis)引起的一種慢性傳染病，在眾多感染性疾病當中，結核病的致死率要高于其他疾病[4]。活動性肺結核是指痰涂片陽性者，證明有結核分枝桿菌排出、病灶屬于活動期、胸片上常有斑片狀陰影或結核空洞，或者播散病灶，說明結核分枝桿菌繁殖活躍、毒力強。活動性肺結核患者體內大量炎癥因子的表達上調、促進炎癥的級聯放大[5]，形成肺內炎癥“瀑布”反應，在該過程中白介素-6(Interleukin-6，IL-6)是激活單核細胞和組織巨噬細胞引起免疫反應的重要淋巴因子，其可將前體B細胞轉化為成熟B細胞[6]。miR-96屬于微小 RNA，在結核病患者血清中表達升高，其對活動性肺結核患者體內大量炎癥因子具有調控作用[7]。本研究探究miR-96 調節結核分枝桿菌誘導的活動性肺結核患者體內炎性因子表達變化的機制，為活動性肺結核患者的臨床診療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

純種雌性成年SD大鼠來自斯貝福生物有限公司，28～32周齡，體質量320～350 g。小鼠抗人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNFα)、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、IL-6和叉頭框蛋白P3(Forkhead box protein P3，FOXP3)蛋白含量單克隆一抗來自美國CST公司，相應二抗來自碧云天公司。PBS等試劑均來源于天津標準科技有限公司，miR-96基因的引物設計來自天津賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組 將30只SD大鼠隨機均分為正常組、模型組和給藥組，模型組在大鼠尾靜脈注射由結核病人痰中分離得到的結核分枝桿菌懸液0.1 mL(濃度1 g/L)，正常組注射生理鹽水0.1 mL，給藥組注射含有異煙肼的同等濃度的結核分枝桿菌菌液0.1 mL。注射由結核病人痰中分離得到的結核分枝桿菌按照結核病診斷細菌學檢驗規程檢驗鑒定，取分裂旺盛的模型菌，稀釋到200倍。

1.2.2樣本采集 于注射后72 h處死大鼠，打開大鼠胸腔并結扎大鼠肺動靜脈；洗肺后，收集支氣管肺泡灌洗液。肺左葉的一部分保留在超低溫冰箱中提取總蛋白質和RNA，切除右肺中葉稱重(肺濕重)、56 ℃的恒溫箱中干燥72 h后再次稱重(干重)、計算濕重與干重之比(W/D)。

1.2.3結核菌菌落計數 稱取肺臟組織1 g，用生理鹽水制備菌懸液，后用硫酸消化，接種在斜面培養基37 ℃下培養5周后評價結核分枝桿菌生長情況，采用ZX-400型全自動菌落計數儀對整塊標本的菌落的結核菌菌落進行計數。

1.2.4RT-PCR法測定基因表達量 取出部分肺部組織，用配置好的PBS沖洗3次，加入細胞裂解液在混勻機下冰浴破碎，于7 500 r/min下、于離心機中4 ℃離心15 min，收集上清液于-80 ℃下凍存，使用時沸水浴煮沸5 min，4 ℃保存。使用軟件設計細胞miR-96及β-actin上下游引物序列，選取長度小于150 bp的片段。RNA的提取：將各組樣本加入到離心管以后，加入Trizol試劑后加入氯仿繼續離心取上清，加入異丙酚，吸取上清取沉淀，最后用DEPC水溶解，于PCR擴增儀中擴增。上樣：將50×的TAE 稀釋為1×TAE 溶液作為溶劑，稱取瓊脂糖0.52 g，加入到1×TAE溶液當中。微波爐加熱煮沸后加入4 μL的核酸染料，搖晃混勻。在去除DNA以后，對提取的RNA進行反轉錄，反應條件為60 ℃、40 min；70 ℃、5 min、4 ℃、30 min。miR-96以及β-actin引物由天津賽默飛公司提供，miR-96：AGTCGTAGCTGTGCTGAGAA GATGCTGCTCGATATAGCAAAT，長度120 bp；β-actin：AATTGACGGCTGTAATCGATC GATGCGACGATGSSTCGCGTAA，長度115 bp。將瓊脂糖凝膠水平放入電泳槽，依次加入6 μL的DNAMaker以及目的基因PCR擴增產物。

1.2.5Western blot法測定TNFα、IL-2、IL-6和FOXP3蛋白含量 取出部分肺部組織，用配置好的PBS沖洗3次，加入細胞裂解液在混勻機下冰浴破碎，于7 500 r/min下、于離心機中4 ℃離心15 min，收集上清液于-80 ℃下凍存，使用時沸水浴煮沸5 min，4 ℃保存。用考馬斯亮藍法檢測各管吸光值，并將各組蛋白濃度調至同樣后進行蛋白上樣。將電泳轉移后的NC膜放入孵育盒中，將凝膠接觸的表面向上放置，加入適量含有5%脫脂乳粉的PBST緩沖溶液覆蓋NC膜，于水平搖床封閉1.5 h后取出封閉后的NC膜，用PBS洗滌3次，PBST洗滌1次；用TBST緩沖液將一抗兔抗鼠IL-2、IL-6、TNFα、FOXP3以及β-actin的抗體稀釋1 000倍，將一抗工作液與NC膜充分接觸，4 ℃下孵育過夜。取出孵育一抗的NC膜，用PBS洗滌3次，PBST洗滌1次后用PBST緩沖液將二抗稀釋1 000倍，將二抗工作液逐滴加入到NC膜上，室溫孵育1 h。取出孵育二抗的NC膜，回收相應二抗。將ECL化學發光液中A液與B液按照1 ∶1混合，并使其與暗盒中的NC膜充分接觸，使用顯影液及定影液對膠片進行顯色，拍照記錄，根據目的條帶灰度值比較差異表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 體質量及肺葉組織干濕重

在造模以后，模型組大鼠的體質量低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；異煙肼藥物治療組大鼠的體質量恢復。肺組織稱重結果顯示，模型組大鼠的肺濕重、W/D低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；而異煙肼治療組大鼠的肺濕重、W/D與抑制組相比恢復明顯，各指標更接近于正常組。見表1。

表1 各組大鼠體質量及肺葉組織干濕重比較Tab.1 Comparison of rat body weights and lung dry/wet weights in each

2.2 CFU活菌計數和miR-96基因表達

正常組肺組織中無結核分枝桿菌及其它菌類。與模型組相比，給藥組肺組織CFU活菌計數降低，差異有統計學意義(P<0.05)，顯示異煙肼可降低由結核病引起的活菌數。與正常組相比，模型組大鼠的miR-96基因表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。異煙肼給藥組的miR-96基因表達量較模型組恢復明顯，略低于正常組(P<0.05)。見表2；顯示活動性肺結核會抑制miR-96基因的表達，異煙肼可降低此抑制，從而緩解病癥。

表2 各組大鼠肺組織中CFU活菌計數和miR-96基因表達Tab.2 CFU viable counts and miR-96 gene expression in rat lung tissues in

2.3 TNFα及IL-2蛋白表達

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中的TNFα及IL-2蛋白表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；異煙肼給藥組大鼠肺組織中的TNFα及IL-2蛋白表達量與模型組相比降低，更接近于正常組(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠肺組織中的TNFα及IL-2蛋白表達情況Fig.1 Expression levels of TNF α and IL-2 protein in rat lung tissues in each group

表3 各組大鼠肺組織中TNFα及IL-2蛋白表達Tab.3 Comparison of TNF α and IL-2 protein expression of rat lung tissue

2.4 IL-6和FOXP3蛋白表達

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中的IL-6和FOXP3蛋白表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；而給藥組大鼠肺組織中的IL-6和FOXP3蛋白表達恢復明顯(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠肺組織中IL-6和FOXP3蛋白表達情況Fig.2 Expression levels of IL-6 and FOXP3 protein in rat lung tissue in each group

表4 各組大鼠IL-6和FOXP3蛋白相對表達量Tab.4 Comparison of the expression levels of IL-6 and FOXP3 protein in each

3 討論

結核病通常與人類免疫密切相關，研究免疫系統的改變一直是結核病的研究重點。在結核病的發生發展過程中，存在細胞和體液免疫缺陷。參與細胞免疫反應的細胞主要有巨噬細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞[8]。菌落的數量直接反應結核病的嚴重程度[9]，這表明，模型組的體外培養菌落數高于正常組，正常組基本無結核分枝桿菌生長。給藥組與模型組相比，少見結核分支桿菌生長。說明經過治療以后患病大鼠的病癥減輕，結核治療效果明顯。微RNA與肺結核的關系已有研究，微RNA可作為促進或者抑制癌癥的基因，調控細胞凋亡[10]。在乳腺癌和子宮內膜異位癥患者中發現miRNA的異常表達[11]。在NIH3T3細胞中，紫外線輻射增加部分miRNA的表達，表現出較強的的抗腫瘤作用[12]。此外，過表達抑癌基因NGX6可降低相應miRNA的表達，證實部分miRNA是癌癥基因[13]。根據生物信息學預測，miR-96可能是調控IL-6的上游miRNA。本研究發現活動性肺結核大鼠肺組織中的miR-96下調，而異煙肼給藥組的miRNA96基因表達量較模型組恢復明顯，略低于正常組，這說明miRNA96與活動性肺結核的關聯性。

研究證實，參與結核病免疫應答的細胞因子包括Th1型細胞因子如IL-2、IFN-α[14]，Th2型細胞因子如IL-5、IL-4，促炎細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6[15]。當肺部受到結核分枝桿菌攻擊時，結核分枝桿菌的抗原或代謝產物會激活肺部巨噬細胞產生炎性因子(TNF-α和IL-2等)[16]。炎癥因子進一步促進肺巨噬細胞和支氣管上皮細胞產生IL-6。細胞因子和內毒素激活單核吞噬細胞可誘導血液中TNF-α、IL-6的升高[17]。IL-6在免疫應答、炎癥、細胞分化、凝血以及腫瘤的發生發展中發揮重要作用。IL-6升高可通過與IL-6受體[18]結合而誘發炎性疾病。在炎癥反應中，IL-6可使其他炎癥細胞趨化，如中性淋巴細胞和單核吞噬細胞[19]。在本研究中，本研究檢測到活動性肺結核組肺部組織中的IL-6和蛋白表達與正常組大鼠相比明顯升高。這表明，結核分枝桿菌感染引起的肺部受損細胞激活了單核細胞和淋巴細胞，并分泌大量IL-6因子，產生大量抗原免疫應答。

FOX是細胞的轉錄因子的一種[20]，激活的FOXP3與細胞周期的阻遏相關，本實驗結果表明，模型組的FOX表達量明顯高于正常組，說明結核分枝桿菌導致的巨噬細胞的凋亡是通過FOX途徑，在給予藥物治療后，FOX表達量明顯降低，基本接近正常水平。此外，本實驗也發現活動性肺結核大鼠體內肺組織中的IL-2、TNFα蛋白表達量相應升高。

綜合上述，miR-96和IL-6水平在一定程度上反映了肺結核的炎癥反應和組織病變，在活動性肺結核中，miR-96、IL-6與免疫系統存在內在調控關系，異煙肼的治療可降低miR-96和IL-6水平，緩解其致病作用。