MST過(guò)表達(dá)及亞砷酸鈉對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的影響*

潘際剛， 吳昌學(xué)， 齊曉嵐， 范海瓊， 李成， 朱衛(wèi)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

研究表明，砷暴露可干擾人及大鼠神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)育、導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶障礙，砷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害已引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[1-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鈉損傷神經(jīng)細(xì)胞、抑制巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶-MST(內(nèi)源性硫化氫合成酶)表達(dá)、增加細(xì)胞S期比例、升高P53蛋白水平，CyclinA、CDC25A與CDK2表達(dá)均下降；而外源性過(guò)表達(dá)MST蛋白可以拮抗砷所致的細(xì)胞S期阻滯、神經(jīng)毒性損傷[5-6]，然而，內(nèi)源性H2S對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞砷毒性損害的凋亡機(jī)制仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)以MST基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞為研究對(duì)象，建立NaAsO2損傷神經(jīng)細(xì)胞模型，對(duì)砷誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白含量和活性進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討內(nèi)源性H2S對(duì)抗砷誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞來(lái)源于本室構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MST基因重組慢病毒載體的SH-SY5Y細(xì)胞株[7]。NaAsO2(美國(guó)Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，抗Bcl-2多克隆抗體、抗Bax多克隆抗體(美國(guó)ImmoLunoWay公司)，GAPDH多克隆抗體(杭州賢至公司)，山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋公司)，Caspase3活性試劑盒(上海貝博公司)，蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，ECL發(fā)光試劑(美國(guó)MilliPore公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組及處理 將空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞、MST基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞各分為對(duì)照組、NaAsO2組、TUDCA(?；切苊撗跄懰?組及TUDCA+NaAsO2組，將細(xì)胞暴露于0或50 μmoL/L NaAsO224 h后進(jìn)行檢測(cè)。TUDCA預(yù)處理細(xì)胞24 h后進(jìn)行后續(xù)染砷實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞鋪96孔板，培養(yǎng)24 h后加藥。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h各培養(yǎng)孔加入5 mg/L MTT 10 μL培養(yǎng)4 h后，吸出每孔液體并加入150 μL DMSO，震蕩10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.3Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 提取細(xì)胞總蛋白，將細(xì)胞蛋白上樣、12%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上經(jīng)脫脂奶粉封閉2 h后，加—抗(Bcl-2、Bax和GAPDH，1 ∶1 000)及二抗(1 ∶3 000)，ECL顯色曝光。

1.2.4Caspase-3活性檢測(cè) 收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，加入裂解緩沖液、渦旋震蕩15 s、4 ℃離心5 min，上清轉(zhuǎn)移離心管中。取上清液10 μL用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞中的Caspase-3活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 空轉(zhuǎn)組細(xì)胞活力

NaAsO2處理空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而用1 mmoL/L內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑TUDCA預(yù)處理細(xì)胞24 h后，則NaAsO2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷被有效逆轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

注：(1)與對(duì)照組比較， P<0.01;(2)與NaAsO2組比較，P<0.01。圖1 空轉(zhuǎn)組細(xì)胞活力在NaAsO2和TUDCA處理后的變化Fig.1 Changes of the cell viability after treatments with NaAsO2 and TUDCA in cells transfected with empty vector

2.2 空轉(zhuǎn)組細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)和Caspase-3活性

如圖2檢測(cè)結(jié)果所示，空轉(zhuǎn)染細(xì)胞在NaAsO2暴露24 h后，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，Bax蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NaAsO2誘導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)的下降和Bax蛋白的表達(dá)升高可被TUDCA預(yù)處理明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。同時(shí)，Caspase-3活性檢測(cè)表明，NaAsO2誘導(dǎo)空轉(zhuǎn)染細(xì)胞Caspase-3活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，卻被TUDCA預(yù)處理所完全逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01; (2)與NaAsO2組比較，P<0.01。圖2 空轉(zhuǎn)組Bcl-2和Bax表達(dá)在NaAsO2和TUDCA處理后的變化Fig.2 Changes of the protein expression levels of Bcl-2 and Bax after treatments with NaAsO2and TUDCA in cells transfected with empty vector

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01;(2)與NaAsO2組比較，P<0.01。圖3 空轉(zhuǎn)組Caspase-3活性在NaAsO2和TUDCA處理后的變化Fig.3 Changes of the Caspase-3 activity after treatments with NaAsO2 and TUDCA in cells transfected with empty vector

2.3 MST過(guò)表達(dá)細(xì)胞活力

MTT結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)MST蛋白的細(xì)胞經(jīng)NaAsO2暴露24 h，細(xì)胞活力并無(wú)顯著性改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TUDCA預(yù)處理對(duì)NaAsO2暴露或不暴露細(xì)胞活力均無(wú)顯著性影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 MST過(guò)表達(dá)細(xì)胞活力在NaAsO2和TUDCA處理后的變化Fig.4 Effects of MST overexpression on the cell viability after treatments with NaAsO2 and TUDCA

2.4 MST過(guò)表達(dá)細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)和Caspase-3活性

Western Blot結(jié)果表明，NaAsO2誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)MST蛋白的細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5A)；而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5B)。TUDCA預(yù)處理則逆轉(zhuǎn)了NaAsO2對(duì)Bcl-2蛋白的升高效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5A)，但不影響B(tài)ax蛋白的表達(dá)(P>0.05，圖5B)。Caspase-3活性檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)MST蛋白的細(xì)胞經(jīng)NaAsO2暴露24 h，Caspase-3無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；并且TUDCA預(yù)處理后暴露或不暴露于NaAsO2對(duì)Caspase-3活性均沒(méi)有影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖6。

注：(1)與對(duì)照組比較， P<0.01; (2)與NaAsO2組比較，P<0.01。圖5 MST過(guò)表達(dá)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2和Bax的影響Fig.5 Effects of MST overexpression on the protein expressions of Bcl-2 and Bax in the SH-SY5Y cells

圖6 MST過(guò)表達(dá)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞Caspase-3活性的影響Fig.6 Effects of MST overexpression on Caspase-3 activity in the SH-SY5Y cells

3 討論

在生物體內(nèi)存在促凋亡和抗凋亡雙向調(diào)節(jié)，決定細(xì)胞生存或凋亡。Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2在調(diào)控凋亡方面發(fā)揮著重要的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的降低和Bax的增加參與了As2O3誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生[9-10]。據(jù)報(bào)道，在飲水染砷動(dòng)物模型，NaAsO2誘導(dǎo)了大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶的損害，導(dǎo)致血清、腦組織同型半胱氨酸(Hcy)含量顯著增加，同時(shí)海馬CA1區(qū)GRP78、Caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白的增加、Caspase-3表達(dá)上調(diào)、TuNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多，提示砷暴露造成海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]。在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，50 μmoL/L NaAsO2所誘導(dǎo)細(xì)胞活力下降、Bax表達(dá)、Caspase-3酶活性升高及Bcl-2表達(dá)水平的降低均被逆轉(zhuǎn)，提示NaAsO2對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的毒性損害與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)有關(guān)。

胱硫醚-β-合酶、胱硫醚-γ-裂解酶和MST是H2S的3種內(nèi)源性合成酶。其中MST在體內(nèi)具有重要的生理功能[12-16]。同型半胱氨酸(Homocycteine,Hcy)是阿爾茨海默病高發(fā)因素；而H2S供體NaHS能夠拮抗Hcy對(duì)PC12細(xì)胞的損傷發(fā)揮一定保護(hù)效應(yīng)[17-18]。有報(bào)道，腹腔注射N(xiāo)aHS可增加鈾暴露大鼠抗凋亡蛋白Bcl-2，而減少促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，升高 Bcl-2/Bax比值[19]。本課題組發(fā)現(xiàn)，NaAsO2可逐漸降低PC12細(xì)胞內(nèi)的H2S水平；NaAsO2增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)效應(yīng)可被外源性H2S所逆轉(zhuǎn)。過(guò)表達(dá)MST在SH-SY5Y細(xì)胞能發(fā)揮同樣的保護(hù)效應(yīng)，提示H2S參與保護(hù)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞砷毒性損傷可能與降低Hcy水平、Bax表達(dá)，增加Bcl-2表達(dá)有關(guān)。有意思的是，MST過(guò)表達(dá)并不改變細(xì)胞活力、Bax蛋白含量及Caspase-3活性在細(xì)胞染砷后的變化，而且Bcl-2的表達(dá)水平仍高于染砷前，但可被TUDCA所拮抗；然而TUDCA單獨(dú)處理并不影響細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)蛋白及Caspase-3的活性。這提示砷誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴(lài)的細(xì)胞損害；然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與MST過(guò)表達(dá)拮抗砷所致毒性損傷的現(xiàn)象仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。