腫瘤酸性微環境對未成熟樹突狀細胞遷移能力和F-actin表達的影響*

邱煒， 童璐， 黃瑾， 曾柱

(貴州醫科大學 生物與工程學院, 貴州 貴陽 550025)

樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)是一種具有強大抗原攝取和處理能力的抗原提呈細胞，包括未成熟DCs(immol/Lature DCs, imDCs)以及成熟DCs(mature DCs, mDCs)兩個分化階段[1]。imDCs位于皮膚、黏膜等外周組織，主要功能為攝取和處理抗原[1]；獲得抗原后，imDCs遷移向二級淋巴組織，遷移過程中逐漸分化為mDCs[1-2]。在腫瘤免疫中，DCs遷移到淋巴結內向初始T細胞呈遞腫瘤抗原進而誘導特異性抗腫瘤免疫應答[3-4]，然而實際在癌癥患者體內DCs不能有效誘導抗腫瘤免疫應答[4]。越來越多的證據表明，腫瘤微環境對DCs的遷移能力和免疫功能的影響是導致腫瘤免疫逃逸的重要原因之一[5-8]。酸性是腫瘤微環境的一個顯著的生物學特性，具有抑制機體抗腫瘤免疫、促進腫瘤侵襲與轉移功能[9-11]。腫瘤微環境的pH 5.8～7.4，主要來源于碳酸和乳酸[12]。除此之外，腫瘤細胞還表達空泡質子泵和Na+/H+交換體等離子轉運體，將胞內高代謝產生的大量H+泵出胞外，從而導致胞外微環境低pH[13-15]。目前，相關實驗分別從酸度和乳酸2個指標來研究腫瘤酸性微環境對DCs免疫功能的影響，主要是檢測對其表面分子表達的影響[11]。在腫瘤微環境中，imDCs與腫瘤抗原結合，然后遷移到淋巴結內向初始T細胞呈遞腫瘤抗原從而引起免疫應答，遷移過程中imDCs成熟為mDCs[3-4]。本項目通過調節酸度和乳酸來研究腫瘤酸性微環境對imDCs遷移能力和絲狀肌動蛋白(filament actin,F-actin)表達的影響，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物來源 6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠20只，體質量20～25 g，購自本校動物實驗中心，飼養于溫度(22±2)℃、無菌環境下，處理前禁食1 d。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI-1640培養基和10%胎牛血清(美國Gibco公司)，L-(+)-乳酸(美國Sigma公司)，重組鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(recombinat Mouse GM-CSF，rmGM-CSF)和重組鼠白細胞介素4(recombinat Mouse IL-4，rmIL-4；美國Biolegend公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)、Cell Counting Kit 8(CCK8)、羅丹明標記的鬼筆環肽及Triton-X100(北京索萊寶科技有限公司)。CO2培養箱(美國Thermo Fisher公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，臺式低速離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1小鼠處理 小鼠麻醉處死，75%濃度酒精浸泡小鼠10 min，將小鼠放置于解剖操作臺上、固定四肢。剪下小鼠的后腿、小心剔去附著的肌肉和結締組織，取出脛骨與股骨，將其浸泡在75%濃度酒精中5 min，放入消毒過的超凈工作臺上備用。

1.2.2imDCs的誘導及處理 取小鼠股骨與脛骨，無菌剪刀剪斷兩端，RPMI-1640培養基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1 100 r/min離心5 min，棄上清、加紅細胞裂解液，1 100 r/min 離心5 min，棄上清、洗滌，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基重懸細胞而獲得骨髓細胞懸液。利用rmGM-CSF和rmIL-4定向誘導骨髓細胞7 d 獲得小鼠 imDCs后，進行酸度和乳酸處理實驗。24 h后收集處理細胞，進行后續實驗。

1.2.3細胞活力檢測 利用CCK8試劑盒檢測imDCs活力。酸度處理實驗中，imDCs分為4組，分別加pH7.3(對照)、pH6.8、pH6.5和pH5.8條件的RPMI-1640培養基；乳酸處理實驗中，imDCs分為4組，分別加含0(對照)、10、20和40 mmol/L乳酸的RPMI-1640培養基。96孔板中培養各組imDCs(100 μL/孔)24 h，加CCK8溶液(10 μL/孔)，37 ℃、5%CO2條件孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長下測量各個孔吸光度。

1.2.4imDCs遷移能力檢測 采用Transwell系統測定imDCs的遷移能力。分別收集不同酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸(0和20 mmol/L)處理后的細胞，置于Transwell上室，下室放在預先加入RPMI-1640培養基的孔板中，37 ℃、5% CO2條件下24 h，收集 Transwell下室的細胞，細胞計數板計數，獲得的數值與所加入的細胞總數之比為細胞遷移率。

1.2.5共聚焦激光掃描顯微鏡分析 分別收集酸度(pH7.3和pH6.5)和乳酸 (0和20 mmol/L)處理后的細胞，用4%多聚甲醛常溫固定細胞20 min后吸棄，洗滌、加Triton-100、吸棄，加羅丹明標記的鬼筆環肽避光染色12 h、漂洗，加DAPI避光靜置5 min、漂洗，加防熒光淬滅劑油后封片、4 ℃避光保存；使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察、拍照、并用ImageJ軟件測量細胞熒光強度(F-actin表達量)。每個處理組隨機選擇3個細胞測定熒光值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞活力

不同酸度處理結果顯示，處理imDCs 24 h，與pH7.3組的細胞活力相比，pH6.8和pH6.5組細胞活力差異無統計學意義(P>0.05)，pH5.8組細胞活力下降(P<0.01)；乳酸處理結果顯示，與0 mmol/L組細胞活力相比，10和20 mmol/L乳酸組細胞活力的差異無統計學意義(P>0.05)，40 mmol/L組細胞活力明顯下降(P<0.01，圖1)。因此在后續酸度處理實驗中分別將pH7.3和pH6.5處理imDCs 24 h作為對照組和處理組，而乳酸處理實驗中分別將0和20 mmol/L濃度處理作為對照組和處理組。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.01；(2)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖1 腫瘤酸性微環境對imDCs活力的影響Fig.1 Effects of tumor acidic microenvironment on imDCs viability

2.2 imDCs遷移能力

不同pH處理imDCs 24 h，與pH7.3組相比，pH6.5組imDCs遷移率降低(P<0.05)；乳酸處理imDCs 24 h，與0 mmol/L組相比，20 mmol/L乳酸組imDCs遷移率明顯降低(P<0.01，圖2)。結果表明，腫瘤酸性微環境顯著抑制imDCs的遷移能力。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.05；(2)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖2 腫瘤酸性微環境對imDCs遷移能力的影響Fig.2 Effect of tumor acidic microenvironment on migration of imDCs

2.3 腫瘤酸性微環境抑制F-actin的表達

不同酸度處理imDCs 24 h，與pH7.3組相比，pH6.5組F-actin表達明顯降低(P<0.01，圖3)；乳酸處理imDCs 24 h，與0 mmol/L組相比，20 mmol/L乳酸組F-actin表達明顯降低(P<0.01，圖4)。結果表明，腫瘤酸性微環境顯著抑制imDCs的F-actin表達。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.01。圖3 酸度對imDCs 中F-actin表達的影響(600×)Fig.3 Effect of acidity on expression of F-actin in imDCs(600×)

注：(1)與0 mmol/L組比較，P<0.01。圖4 乳酸對imDCs 中F-actin表達的影響(600×)Fig.4 Effect of lactic acid on expression of F-actin in imDCs(600×)

3 討論

基于DCs在機體免疫系統中的重要地位，以DCs為基礎的抗腫瘤免疫治療已成為抗腫瘤治療手段之一，目前已開發出多種療法，然而從臨床試驗結果來看，這些療法的治療效率還不盡人意，存在許多待解決問題，包括腫瘤的免疫逃逸、腫瘤抗原的選擇和負載方法以及過繼回輸時間間隔等[1,3]。目前在尋找新的優化DCs腫瘤疫苗的研究中，如何解除腫瘤免疫抑制進而恢復機體中DCs免疫學功能一直是待解決的重要問題[4,12]。因此，通過對腫瘤微環境中DCs生物學功能的研究，為重塑其免疫功能提供理論依據和技術支持，這對抗腫瘤免疫治療來說具有重要意義。

DCs的遷移能力是發揮其免疫學功能的必要條件[1-2]。在荷瘤宿主體內，DCs不能誘導有效誘導抗腫瘤免疫應答，關鍵的原因是DCs的遷移能力被抑制[3,16]。酸性微環境是多種實體腫瘤微環境的顯著特征，其在腫瘤進展中起到關鍵作用[17-21]。因此，了解酸性腫瘤微環境對DCs遷移能力的影響對進一步理解腫瘤免疫來說具有重要意義。研究結果發現，腫瘤酸性微環境能顯著抑制imDCs遷移，這可能是荷瘤宿主中DCs未能遷移到淋巴結進而導致荷瘤宿主免疫功能受損的重要原因之一。

細胞骨架在維持細胞形態有序性方面起重要作用，主要包括微管、微絲和中間纖維[22-24]。由F-actin構成的微絲能控制細胞遷移能力[24]。F-actin 是多個球狀肌動蛋白(G-actin)亞基組成的絲狀聚合物[25]。F-actin和G-actin的動態結構對DCs的抗原捕獲、遷移能力等功能至關重要[25-27]。在本實驗中，羅丹明標記的鬼筆環肽只能特異性標記F-actin，而不是與G-actin結合。結果顯示細胞外酸性微環境使imDCs中F-actin含量顯著降低，提示酸性微環境可能使F-actin發生了解聚。由于F-actin與DCs的遷移能力密切相關，因此酸性微環境很可能通過調控F-actin聚合進而影響imDCs的遷移能力。

綜上所述，本研究發現腫瘤酸性微環境能抑制imDCs遷移能力和F-actin的表達。