鴨疫里默氏桿菌和鵝細(xì)小病毒混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

袁 標(biāo) ，張 海 ，鄧珊珊 ，藺俐仲 ，袁 林 ，羅登蕎 ，景書(shū)灝 ，徐春志 ，劉 霞 ，楊 源 ，劉 艷

（1.貴陽(yáng)市息烽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽(yáng) 551100；2.貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng)550081；3.貴陽(yáng)市清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽(yáng) 551400；4.貴陽(yáng)市草地站，貴州 貴陽(yáng) 550081；5.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550001）

近年來(lái)貴州大力發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)，其中生態(tài)家禽為農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命重點(diǎn)發(fā)展的特色產(chǎn)業(yè)之一。生態(tài)家禽養(yǎng)殖規(guī)模快速發(fā)展，但是由于部分養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖技術(shù)跟不上、養(yǎng)殖密度增大等原因，鴨場(chǎng)經(jīng)常發(fā)生各類(lèi)疾病，如病毒性疾病、細(xì)菌性疾病和寄生蟲(chóng)病等，其中鴨疫里默氏桿菌病和鵝細(xì)小病毒病，已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌引起的一種急性、敗血性、接觸性傳染病[1]。鴨疫里默氏桿菌屬于里默氏桿菌屬黃桿菌科，革蘭氏染色呈陰性，短桿狀，美蘭染色為兩極濃染，不產(chǎn)生芽孢[2]。鴨疫里默氏桿菌主要易感動(dòng)物為雞、鴨、火雞等，對(duì)2～3周齡雛鴨最易感染。發(fā)病家禽的主要病理變化為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。我國(guó)自20世紀(jì)80年代首次報(bào)道該病以來(lái)，目前已在江蘇、湖南、湖北等地相繼發(fā)生。鵝細(xì)小病毒病是由鵝細(xì)小病毒引起的一種急性傳染病。鵝細(xì)小病毒是細(xì)小病毒科單股線狀無(wú)囊膜DNA病毒，可引起鴨發(fā)生下痢、跛行、后肢癱瘓等臨床癥狀[3]。該病自1971年在法國(guó)首次報(bào)道，2014年后在我國(guó)廣西、江蘇、廣東、福建等水禽養(yǎng)殖集中區(qū)域呈現(xiàn)流行態(tài)勢(shì)[4]。貴州省某鴨場(chǎng)購(gòu)進(jìn) 7日齡雛鴨10000只，飼養(yǎng)至9日齡后鴨群逐漸出現(xiàn)被毛散亂、精神沉郁、行動(dòng)遲緩、站立不穩(wěn)和跛行等臨床癥狀，并有大量雛鴨死亡，雛鴨15日齡時(shí)已死亡4000余只。剖檢病死鴨可見(jiàn)其肝臟腫大呈灰白色、心包膜纖維素性滲出，部分患病鴨脾臟腫大呈大理石樣，腸系膜出血，腸腔腫脹。鴨群6日齡時(shí)使用益康泰、恩諾沙星。7日齡接種禽流感H9+新城疫二聯(lián)滅活疫苗，8日齡投喂氟苯尼考、雙黃連口服液、黃金維他，11日齡接種禽流感H5N1-8+H7二價(jià)滅活疫苗。18日齡注射益康泰、青霉素、鏈霉素，取得了明顯效果。為了進(jìn)一步確診該養(yǎng)鴨場(chǎng)雛鴨異常死亡的病因，采用了流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢、細(xì)菌分離鑒定、細(xì)菌PCR檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)和病毒核酸檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)室診斷方法，以期為后期防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料

選擇患病雛鴨5只，剖檢并無(wú)菌采集其心包液、肝臟組織、腦組織樣本。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL2000、細(xì)菌基因組提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、禽流感病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒、新城疫病毒核酸檢測(cè)試劑盒、鴨圓環(huán)病毒核酸檢測(cè)試劑盒、鵝細(xì)小病毒核酸檢測(cè)試劑盒、鴨坦布蘇病毒核酸檢測(cè)試劑盒、鴨肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京世紀(jì)元享公司；新生牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司；試驗(yàn)所用的抗菌藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；巧克力培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在二級(jí)生物安全柜中無(wú)菌接種5只受檢鴨的心包液、肝臟組織于巧克力瓊脂平板，分別置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行有氧和厭氧恒溫培養(yǎng)18 h。

1.4 病毒核酸檢測(cè)

在二級(jí)生物安全柜中，取病鴨內(nèi)臟及腦組織樣本，加入適量PBS緩沖液，研磨勻漿后，離心取上清，采用RNA/DNA提取試劑盒分別提取病毒RNA/DNA，進(jìn)行禽流感病毒、新城疫病毒、鴨圓環(huán)病毒、鵝細(xì)小病毒、鴨坦布蘇病毒和鴨肝炎病毒核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)

經(jīng)37℃無(wú)氧過(guò)夜培養(yǎng)的巧克力瓊脂平板，菌落表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、半透明呈露滴狀。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢顯示分離菌為革蘭氏陰性短小桿菌。初步判斷為鴨疫里默氏桿菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定

根據(jù)鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)基因設(shè)計(jì)特異性引物，預(yù)擴(kuò)增片段為663 bp。挑取純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落到含5%新生牛血清的液體培養(yǎng)物中，震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌總DNA，加樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入95℃變性45 s、54.1℃退火45 s和72℃延伸45 s的35次循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，鴨疫里默氏桿菌陽(yáng)性對(duì)照和分離菌樣本在663 bp處均出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明本次厭氧培養(yǎng)后分離得到的細(xì)菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) （Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS2010年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。對(duì)分離得到的鴨疫里默氏桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌對(duì)頭孢呋辛、頭孢唑啉、氨芐西林、羧芐西林、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、新霉素和丁胺卡那等抗菌藥物均呈不同程度的耐藥性，而對(duì)頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢拉定、哌拉西林、氧氟沙星、諾氟沙星和米諾環(huán)素等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性。

2.4 病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

對(duì)5份病料組織進(jìn)行禽流感病毒、新城疫病毒、鴨圓環(huán)病毒、鵝細(xì)小病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨肝炎病毒核酸檢測(cè)，其中禽流感病毒、新城疫病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨肝炎病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性，5份樣本均擴(kuò)增出與鵝細(xì)小病毒預(yù)期相符的目的片段，結(jié)果見(jiàn)圖2。提示鴨群存在鴨圓環(huán)病毒感染。

3 結(jié)論

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢、細(xì)菌分離鑒定、細(xì)菌PCR檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)和病毒核酸檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行診斷，確診引起該養(yǎng)鴨場(chǎng)雛鴨異常死亡的病因?yàn)轼喴呃锬蠗U菌和鵝細(xì)小病毒混合感染。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌對(duì)頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢拉定、哌拉西林、氧氟沙星、諾氟沙星和米諾環(huán)素等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性。

4 討論

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，據(jù)報(bào)道已經(jīng)鑒定的血清型有21種，國(guó)內(nèi)主要流行的血清型是1型、2型和10型[5]，不同血清型之間的交叉保護(hù)效果較低，因此使用疫苗免疫后，常常也會(huì)有該病的流行。由于缺乏有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防，臨床上治療鴨疫里默氏桿菌病主要以抗生素為主，但是近年來(lái)隨著養(yǎng)殖量的增加和抗生素的濫用，有的養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)了多重耐藥的情況，所以合理使用敏感抗生素，對(duì)治療和預(yù)防鴨疫里默氏桿菌病顯得十分重要。

臨床上鵝細(xì)小病毒病沒(méi)有特效的治療藥物和疫苗，因此早期的臨床診斷非常重要。臨床上可以根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變，進(jìn)行初步判斷，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行病原確診。鵝細(xì)小病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病毒分離鑒定、免疫組化試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、PCR檢測(cè)、熒光定量PCR檢測(cè)等。由于病毒分離鑒定、免疫組化試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，并且操作繁瑣。PCR檢測(cè)和熒光定量PCR檢測(cè)耗時(shí)相對(duì)較短，是實(shí)驗(yàn)室診斷常用的檢測(cè)方法。

由于鴨疫里默氏桿菌病和鵝細(xì)小病毒病沒(méi)有特效的疫苗和治療藥物，因此只有通過(guò)加強(qiáng)生物安全防控措施來(lái)防止鴨群出現(xiàn)感染。首先必須做好引種檢疫和合群前隔離工作，不在有鴨疫里默氏桿菌病和鵝細(xì)小病毒病流行的區(qū)域和養(yǎng)殖場(chǎng)引種，做好禽流感、新城疫等相關(guān)疫病的基礎(chǔ)免疫工作和免疫抗體監(jiān)測(cè)。加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全體系建設(shè)和飼養(yǎng)管理水平，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生消毒和雛鴨保暖工作，合理使用抗生素和消毒藥物。